绵羊体外早期胚胎转录组学研究

摘要

应用超数排卵和体外受精技术可大规模的生产胚胎，对促进良种扩繁，缩短品种培育过程中世代间隔有重要意义。然而体外胚胎往往因为合子基因不能正常启动，绝大多数的胚胎无法进一步发育。为提高绵羊超数排卵的效率，揭示体外胚胎发育调控机理，本研究优化绵羊成年羊、羔羊超排方案和体外受精相关技术参数，同时以绵羊体外早期胚胎为研究对象，利用高通量测序技术对其进行miRNA和mRNA的转录组分析。试验共分五个部分。
　　试验一:绵羊胚胎体外生产技术研究
　　本试验通过优化绵羊成年羊、羔羊超排方案和绵羊体外受精相关技术参数，为提高绵羊体外胚胎生产效率提供依据。在成年羊研究结果表明，应用加拿大FSH(BionicheanimalhealthCanada)超排的平均黄体数显著高于宁波FSH（12.47±1.54vs9.67±1.93，P＜0.05），应用不同剂量(150mg和120mg)加拿大FSH超排结果差异不显著(P＞0.05)，用30％PVP溶解FSH后超排结果显著低于上述两组(P＜0.05)。羔羊诱导卵泡发育实验结果表明，超排程序对超排效果影响显著，激素递减法处理效果显著优于等量法，诱导发育卵泡数为（101.00±38.32vs.39.00±27.06，P＜0.05）。加拿大FSH超排后回收的可用卵子比例及体外受精后卵裂率均高于宁波FSH组。35-55日龄的羔羊作供体，诱导卵巢卵泡发育的效果较好。卵母细胞成熟培养26-30h效果较好，公羊个体间的差异直接影响着体外受精的效果，为此在体外受精前通过预备试验选择公羊是很必要。本研究可为下一步绵羊体外胚胎样品回收奠定基础。
　　试验二:绵羊体外早期胚胎的小RNASolexa高通量测序
　　miRNA与畜禽的主要生产性能和生长发育密切相关，主要参与细胞分化的调控，细胞增殖的调控，组织及器官生长发育的调控。本研究以绵羊体外不同发育时期的胚胎作为研究对象，回收20850枚体外受精胚胎，通过在构建五个样品小RNA文库的基础上，使用Solexa测序技术，绵羊卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和桑葚胚分别获得19，955，813、12，827，884、16，120，510、14，896，120和17，580，039条原始sRNA序列，卵母细胞与2-细胞公共uniquesRNA序列有44，332种，4-细胞与2-细胞公共uniquesRNA有180，329种，8-细胞与4-细胞公共uniquesRNA有292，820种，8-细胞与桑葚胚公共对应uniquesRNA为31，626种。五个不同发育时期胚胎分别有398、429、467、485和242个miRNA家族参与表达，其中miR-10b在5个时期表达量均最高，表达量最低分别为miR-708-3p、miR-5398-3p、miR-960-3p、miR-99b-3p与miR-874;并预测出1797种novelmiRNA。以上数据极大拓宽了绵羊miRNA数据，为进一步筛选不同发育时期胚胎差异表达miRNA奠定基础。
　　试验三:绵羊体外早期胚胎差异表达miRNA筛选及功能注释
　　miRNA表达具有组织特异性和发育的时序性，在细胞生长发育的不同阶段表达不同种类和数量的miRNA。本研究通过利用Solexa测序技术绵羊体外早期胚胎miRNA的鉴定，进一步筛选出在绵羊卵母细胞与2-细胞期有900种miRNA表达差异，2-细胞与4-细胞期有613种miRNA表达差异，4-细胞与8-细胞期有521种miRNA表达差异，8-细胞与桑葚胚期有551种miRNA表达差异。选择6个已知的miRNA进行了QPCR验证，表达趋势与测序结果吻合。对上述验证的6个差异显著miRNA进行靶基因预测统计，数目分别为mir-28-3p，2430个;mir-202，3540个;mir-150，1577个;let-7b-5p，3045个;mir-21-5p，2411个;mir-143，4181个。预测的靶基因在结合功能和催化活性功能注释基因数量较多，并在13个信号通路显著富集，包括Wnt信号通路、自我吞噬调节和轴突导向等。本实验可为研究探讨miRNA调控绵羊体外胚胎发育的机制提供基础数据。
　　试验四:绵羊体外早期胚胎转录组分析
　　为了全面获得绵羊附植前胚胎表达谱发生的变化，本研究通过构建绵羊体外早期胚胎转录组文库，经Illumina/Hiseq2000测序平台，全面获得绵羊附植前胚胎转录组信息。结果显示，绵羊卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和桑葚胚分别得到53，076，288、54，795，850、54，160，208、51，978，906和54，160，208条Cleanreads，与参考基因组分别比对到的reads所占比例为78.63％、71.45％、73.68％、74.62％和74.06％;五个时期分别获得15，271、14，867、15，025、15，594和16，260个转录本，并且分别预测到7445、8090、8491、8963和8177个新转录本。绵羊体外不同发育时期胚胎主要发生了四种可变剪接ES、IR、A3SS和A5SS，发生SNP数量达到616，234个，优化了37,544个基因，以上数据极大拓宽了绵羊转录组相关信息，为进一步筛选不同发育时期胚胎表达差异基因奠定基础。
　　试验五:绵羊体外早期胚胎差异表达基因筛选及注释研究
　　应用各种方法分离和分析差异表达基因是研究胚胎发育分化的关键，对阐明胚胎发育的内在调控机制具有重要意义，而且还能为基因诊断与治疗及新品种培育提供重要的理论依据。通过采用第二代高通量技术检测绵羊体外不同发育时期胚胎表达谱，筛选出从卵母细胞到2-细胞期共有7950个差异表达基因;2-细胞发育到4-细胞共有1169个差异表达基因;4-细胞发育到8-细胞共有3631个差异表达基因;8细胞发育到桑葚胚共有5851个差异表达基因。在聚类分析中，前两组差异表达基因聚为一类，后两组差异表达基因聚为一类。选择5个基因进行了QPCR验证，表达趋势与测序结果吻合。在GO功能聚类中，差异表达基因分别在细胞位置分别有46、11、31和41个terms显著性富集，在分子功能上分别有25、8、10和15个terms显著性富集，其中结合功能和蛋白结合功能两个条目富集的基因数量最多。差异表达基因参与的生物过程分别有57、44、77和45个条目。其中主要参与的有发育过程、多细胞生物发育、RNA加工和细胞生物合成过程等。在KEGG分析中，卵母细胞与2-细胞期差异基因共在194条通路显著性富集。2-细胞与4-细胞期差异基因只在癌症信号通路富集。4-细胞与8-细胞期差异基因共在4条通路显著性富集。8-细胞与桑葚胚差异基因在165条通路显著性富集。本实验结果为进一步研究绵羊体外早期胚胎发育相关机制研究奠定基础。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语中英文对照

第一章 文献综述

1．表达谱芯片技术在胚胎方面的研究应用

1．1 表达谱芯片技术在小鼠胚胎中的研究进展

1．2 表达谱芯片技术在牛胚胎中的研究进展

1．3 表达谱芯片技术在猪胚胎中的研究进展

2．转录组测序技术应用

2．1 转录组测序技术应用领域

2．2 转录组测序技术优势

3．microRNAs在动物胚胎发育中研究进展

3．1 miRNA的发现

3．2．miRNA的体内生成机制

3．3 miRNA作用机制

3．4 不同动物胚胎的miRNA的鉴定和研究

4．动物早期胚胎发育基因研究进展

4．1 动物卵母细胞母源基因的表达对早期胚胎发育的影响

4．2 胚胎基因组激活

4．3 合子型基因表达与调控

5 本研究目的和意义

参考文献

第二章 绵羊胚胎体外生产技术研究

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要药品

1．3 仪器与设备

1．4 主要溶液配制

1．5 实验设计

2 结果与分析

2．1 成年羊胚胎生产技术研究结果

2．2 羔羊体外生产胚胎研究结果

3 讨论

3．1 绵羊超数排卵及诱导卵泡发育

3．2 卵母细胞的体外成熟

3．3 影响精子体外获能和体外受精的因素

4 小结

参考文献

第三章 绵羊体外早期胚胎的小 RNA Solexa高通量测序

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 主要仪器

1．3 生物网站

1．4 实验方法

2 结果与分析

2．1 胚胎回收

2．2 总RNA提取及质量鉴定

2．3 绵羊体外发育5个时期测序数据产出统计

2．4 小RNA长度分布统计

2．5 文库间公共及特有序列统计

2．6 小RNA的基因组比对

2．7 小RNA的基因组分布

2．8 小RNA的分类注释

2．9 已知miRNA鉴定：表达谱信息

2．10 候选miRNA前体预测

2．11 候选miRNA首位碱基偏向性

3 讨论

3．1 关于miRNA的鉴定方法

3．2 关于在胚胎中提取RNA的方法

3．3 在绵羊体外早期胚胎中小RNA总体组成上具有明显差异

3．4 已知mlRNA鉴定和预测新的miRNA

4 小结

参考文献

第四章 绵羊体外早期胚胎差异表达miRNA筛选及功能注释研究

1 材料与方法

1．1 试验动物与样品采集

1．2 主要试剂和试剂盒

1．3 主要仪器

1．4 实验方法

2 结果

2．1 miRNA差异表达分析结果

2．2 miRNA聚类分析

2．3 Real time qRT-PCR验证miRNA测序结果

2．4 miRNA靶基因预测

2．5 6个差异表达miRNA靶基因功能富集分析

3 讨论

3．1 miRNA差异分析结果

3．2 miRNA靶基因预测及功能注释

4 结论

参考文献

第五章 绵羊体外早期胚胎转录组分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 主要仪器

1．3 实验方法

2 结果

2．1 测序质量评估

2．2 与参考基因组和参考基因比对

2．3 Reads在参考基因上的分布

2．4 基因覆盖度及基因表达量统计

2．5 新转录本预测

2．6 可变剪接分析(AS)

2．7 基因结构优化

3 讨论

3．1 绵羊体外早期胚胎转录组数据分析

3．2 绵羊体外早期胚胎转录组数据与参考基因比对分析

3．3 绵羊体外早期胚胎可变剪接分析

4 结论

参考文献

第六章 绵羊体外早期胚胎差异表达基因筛选及功能注释研究

1 材料与方法

1．1 试验动物与样品采集

1．2 主要试剂和试剂盒

1．3 主要仪器

1．4 实验方法

2 结果

2．1 差异表达基因筛选

2．2 差异表达基因Real-time qRT-RCR验证

2．3 差异基因表达模式聚类分析

2．4 差异表达基因所处的的细胞位置富集

2．5 差异表达基因参与的分子功能富集

2．6 差异表达基因参与分子过程富集

2．7 差异表达基因通路显著性富集分析

3 讨论

3．1 差异表达基因分析

3．2 差异表达基因的GO功能富集和通路分析

4 结论

参考文献

全文结论

创新之处

在读期间发表的论文

致谢