玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及噬菌体单链抗体的筛选

摘要

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，主要污染玉米、大麦、小麦、燕麦和高粱等作物。ZEN除具有很强雌激素样作用可产生生殖毒性外，还具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性、潜在致癌性。该毒素可通过污染了ZEN的谷物及其制品或者残留有ZEN的肉、奶等进入动物和人体内，给畜牧业和人类健康造成威胁。
　　对ZEN进行及时准确的检测是预防和控制其危害的有效手段。我国《GB13078.2-2006饲料卫生标准-饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》要求，配合饲料、玉米中的ZEN允许量为500μg/kg。2011年出台的《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》中规定了谷物及其制品中ZEN限量为60μg/kg。只有根据国家标准对饲料和谷物及其制品中的ZEN进行准确有效的检测才能从源头上杜绝ZEN对畜牧行业和人类健康的威胁。目前，用于检测ZEN的方法有高效液相色谱法、气相色谱、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法及免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法的前处理简单、操作易掌握而且便特异性强、灵敏度高。这使得免疫学检测方法成为被广泛应用的检测方法。
　　高品质抗体是免疫学检测方法的基础，本试验制备了可稳定分泌抗ZEN的单克隆抗体细胞株，并从杂交瘤细胞株中提取RNA，通过基因工程技术获得了抗ZEN阳性噬菌体单链抗体，为从基因工程抗体途径获得ZEN免疫学检测中所需要的高品质抗体奠定了基础。
　　试验Ⅰ玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备本试验用ZEN与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应生成玉米赤霉烯酮肟(ZEN-CMO)，用紫外连续波谱扫描法对ZEN-CMO进行鉴定，同时计算ZEN-CMO的肟化率;用活性酯法将ZEN-CMO与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成免疫抗原;用醛法将ZEN与卵清蛋白(OVA)偶联合成包被抗原，用紫外连续波谱扫描法对免疫抗原与包被抗原进行鉴定;通过常规免疫和联合脾内免疫获得的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，间接竞争ELISA检测其特异性。结果表明:ZEN-CMO合成成功，肟化率为65.0％;免疫抗原与包被抗原合成成功;筛选到一株阳性杂交瘤细胞将其命名为4C8;经鉴定4C8抗体亚型为IgG2b，轻链为κ链;染色体平均计数为104条;SDS-PAGE电泳呈现约为25kDa、50kDa的两条蛋白条带;间接ELISA检测细胞培养上清的效价为1∶512，腹水效价为1∶9600，纯化腹水蛋白浓度为1.639g/L;细胞培养上清对ZEN具有特异性。以上结果说明:杂交瘤细胞株4C8可用于玉米赤霉烯酮单链抗体的制备。
　　试验Ⅱ玉米赤霉烯酮噬菌体单链抗体的筛选与表达从已筛选得到的杂交瘤细胞提取总RNA，经RT-PCR扩增出重链可变区VH和轻链可变区VL，将Linker与VH、VL通过SOE-PCR按VH-Linker-VL方式拼接成scFv片段，将scFv基因和pCANTAB5E载体分别用sfiⅠ和NotⅠ双酶切后连接并转化E.coliTG1，经过辅助噬菌体M13K07的挽救，构建噬菌体单链抗体的初级抗体库;以ZEN-OVA为包被抗原，进行富集筛选，将阳性噬菌体抗体库上清感染E.coliHB2151用IPTG诱导表达。结果表明:经过3轮的亲和富集后抗体库总富集倍数达到66.2倍，滴度达到3.7×106cfu/mL，通过phage-ELISA筛选出3株特异性抗ZEN的单链抗体菌株;用IPTG成功诱导表达35kDa左右的可溶性目的蛋白，用BandScan软件分析目的蛋白表达量，确定最佳诱导温度为30℃，IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol/mL，最佳诱导时间为4h;WesternBlot鉴定其对ZEN具有特异性。以上结果说明:本实验通过基因工程技术获得的重组单链抗体可以进行可溶性表达，且可溶性表达产物对ZEN具有特异性。

目录

声明

摘要

符号与缩略语

第一章 玉米赤霉酮的危害及单链抗体的研究进展

1 玉米赤霉烯酮的危害

1．1 玉米赤霉烯酮的理化性质

1．2 玉米赤霉烯酮毒性作用

1．3 玉米赤霉烯酮的污染概况

1．4 玉米赤霉烯酮限量标准

1．5 玉米赤霉烯酮检测方法

2 单链抗体的研究进展

2．1 单链抗体

2．2 噬菌体展示技术

2．3 噬菌体抗体库技术展示单链抗体

2．4 噬菌体展示单链抗体应用于真菌毒素检测

参考文献

第二章 玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 半抗原ZEN-CMO制备

2．2 免疫抗原及包被抗原的鉴定

2．3 ELISA包被抗原工作浓度及阳性细胞上清的确定

2．4 阳性杂交瘤细胞的筛选

2．5 单克隆抗体特性的鉴定

3 讨论

3．1 半抗原的制备

3．2 完全抗原制备

3．3 单克隆抗体的制备

参考文献

第三章 玉米赤霉烯酮噬菌体单链抗体的筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 RNA浓度测定及电泳鉴定完整性

2．2 抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段制备

2．3 全长单链抗体(scFv)的拼接产物片段

2．4 重组噬菌粒的构建与鉴定

2．5 噬菌体单链抗体库富集结果

2．6 phage-ELISA筛选结果

2．7 玉米赤霉烯酮单链抗体可溶性表达结果

2．8 玉米赤霉烯酮单链抗体可溶性表达鉴定

3 讨论

3．1 单链抗体库构建与筛选

3．2 玉米赤霉烯酮单链抗体表达

参考文献

全文总结

致谢