β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及酶的定向进化研究

摘要

β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶，通过和β-葡聚糖酶系的其他酶类协同作用，可有效水解大麦等禾本科植物种子中的β-葡聚糖，提高啤酒在糖化时的过滤速度和动物对饲料的利用率。目前，工业上应用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要来源于微生物，尤其是芽孢杆菌。但是已筛选并鉴定的芽孢杆菌源β-1，3-1，4-葡聚糖酶普遍存在酶活低或热稳定性差等问题，这就在一定程度上限制了其工业化应用。因此，对原有产β-1，3-1，4-葡聚糖酶菌株进行遗传改良，以获得高产菌株，或利用基因工程或者蛋白质工程改善酶的性能，具有重要理论研究意义和实际应用价值。
　　本论文主要对产热稳定性β-1，3-1，4-葡聚糖酶的高地芽孢杆菌的诱变育种、β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和异源表达，以及β-1，3-1，4-葡聚糖酶的定向进化进行了研究，旨在获得β-1，3-1，4-葡聚糖酶高产菌株以及高活力β-1，3-1，4-葡聚糖酶，为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的工业生产和应用奠定基础。主要研究结果如下:
　　1.采用物理化学诱变对高地芽孢杆菌YC-9进行了诱变育种。
　　首先对高地芽孢杆菌YC-9进行了NTG和LiCl诱变处理，确定了二者的最佳处理浓度分别为0.08mg/ml和0.08g/ml。经过一轮诱变，筛选到一株酶活提高26.8％的菌株，命名为N-1-7;在此基础上进行了第二轮NTG诱变，筛选到一株酶活较原始菌株提高134.4％的高产菌株，命名为N-2-2;最后以N-2-2为出发菌株，进行了N+束注入诱变，获得一株酶活提高26.2％的菌株，命名为10-30s-3。
　　2.对高地芽孢杆菌YC-9产β-1,3-1，4-葡聚糖酶进行了异源表达和酶学性质研究。
　　将高地芽孢杆菌YC-9的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与表达载体pET-28a(+)连接，构建了非融合表达载体pET-28a-Glu，并在E.coli BL21(DE3)中获得了活性表达。在接种量为2％,30℃下诱导6h后，大肠杆菌胞内酶活达79.2U/ml。依次经过硫酸铵盐析、DEAE-sephacel阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析，获得电泳纯的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，分子量大小在27KDa左右，与理论值相符。对重组酶酶学性质进行研究，结果显示重组酶的最造反应温度为60℃，最适反应pH为7.0;在60℃以下和pH5.0-9.0时保持稳定。
　　3.对高地芽孢杆菌YC-9所产β-1,3-1，4-葡聚糖酶进行了定向进化研究。
　　首先确定了定向进化中的高通量筛选方法，进一步对易错PCR反应的Mg2+和Mn2+浓度进行了研究，最终确定了两个最适Mg2+和Mn2+组合，分别为4mM和0.45mM以及6mM和0.3mM。经过一轮易错PCR，筛选到两个突变酶Glu-167和Glu-1544，酶活较原始酶分别提高42.4％和75.9％。序列分析表明，突变酶Glu-167发生了三个氨基酸的变化，分别为K142N、Q203L和N214D，突变酶Glu-1544发生了一个氨基酸的变化，为L11Q。
　　采用SWISS-MODEL对突变酶Glu-167进行三级结构预测，结果显示T31P位于底物结合口袋的底部，N41S位于连接两个β-折叠层的第一个环状弯曲中，I135L位于保守区EIDIE中。分析推测，三处氨基酸变化可能是通过影响酶蛋白结构中次级键的形成以及使活性中心的结构发生改变等共同影响着酶蛋白的催化活性，并最终使突变酶Glu-167的催化活性提高。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶概述

2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的结构和性质

3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶高产菌株的诱变选育

4 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆表达研究

4．1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆

4．2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的异源表达

5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的定向进化研究

5．1 定向进化技术简介

5．2 高通量筛选技术

5．3 定向进化技术在β-1，3-1，4-葡聚糖酶改造中的应用

6 研究目的、意义及内容

参考文献

第二章 产β-1，3-1，4-葡聚糖酶高地芽孢杆菌YC-9理化诱变研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 高地芽孢杆菌YC-9生长曲线及产β-1，3-1，4-葡聚糖酶动态曲线

2．2 高地芽孢杆菌YC-9的化学诱变

2．3 低能N+束注入诱变

2．4 遗传稳定性实验

2．5 诱变菌株与原始菌株的生长产酶情况比较

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 高地芽孢杆菌YC-9 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆表达及重组酶性质研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的扩增

2．2 重组质粒pMD19-T-Glu的鉴定

2．3 重组表达载体pET28a-Glu的鉴定

2．4 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的诱导表达

2．5 重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶的纯化

2．6 重组酶的酶学性质研究

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 高地芽孢杆菌YC-9 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的定向进化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 高通量筛选方法的建立

2．2 易错PCR反应体系中Mg2+和Mn2+浓度的优化

2．3 突变库的构建及筛选

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

攻读硕士期间发表论文情况

致谢