猪链球菌2型不同毒力菌株的鉴别及Pan-genome分析

摘要

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种重要的人畜共患病病原，可引起人和猪的败血症、关节炎、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病，严重威胁公共卫生安全。根据荚膜多糖抗原的不同，可将猪链球菌分为33个血清型（1/2，1-31，33），其中血清型2型(SS2)在世界范围内报道最多且致病性最强。我国曾爆发两次人感染SS2疫情，并造成严重的人员伤亡。目前，对SS2毒力因子的研究逐渐增加，但是其致病机理仍不明确。SS2不同菌株致病力存在差异，但是缺乏合适的毒力评价体系，严重阻碍对致病性SS2的鉴定。本研究将斑马鱼感染模型“内标”化，并成功筛选到若干SS2弱毒株。通过对SS2泛基因组（pan-genome）的分析，鉴定出强、弱毒株基因组的系列差异，为进一步研究SS2致病机理提供理论依据。
　　1猪链球菌2型弱毒菌株的筛选
　　综合考虑菌株分离时间和地域跨度，从本室菌种库挑选105株SS2菌株，通过PCR检测菌株中菌毛相关基因sbp2'和毒力相关基因mrp，epf, sly的分布，并鉴定出sbp2'/mrp-/epf-/sly-、sbp2'+/mrp+/epf+/sly+等6种基因型。利用斑马鱼感染模型测定不同基因型菌株的毒力，并以已知的弱毒株T15和强毒株ZY05719作为参考菌株，即“内标”。通过比较待检菌株和参考菌株的半数致死量(LD50)，评估待检菌株毒力水平。结果表明，我们成功筛选到16株SS2弱毒株，基因型为sbp2'-/mrp-/epf-/sly-(13株)或sbp2'-/mrp+/epf+/sly+(3株)，这也说明菌毛相关基因sbp2似乎比mrp，epf, sly更适合作为SS2毒力靶基因。
　　2猪链球菌2型泛基因组分析
　　选取7株SS2弱毒株完成基因组测序，并结合NCBI数据库，共获得10株强毒株和9株弱毒株全基因组信息，以此进行猪链球菌2型泛基因组(pan-genome)分析。结果显示，pan-genome由1，239个核心基因和2，436个可变基因组成，进化分析表明强、弱毒株进化差异明显，9株弱毒株又可分为Ⅰ、Ⅱ两组（两个分支）。噬菌体预测分析发现，弱毒株中含有更多前噬菌体序列。通过比较强毒株和弱毒株各自的核心基因组(core-genome)，发现了强毒株共同特有的菌毛相关基因簇。通过比较强毒株和Ⅱ组弱毒株的core-genome，鉴定出强、弱毒株各自特有的53和58个基因。
　　3 mrp基因型与猪链球菌2型菌株的毒力关系
　　Pan-genome分析涉及的9株弱毒株的core-genome由1，459个基因组成，其中包括mrp基因，与我们筛选出的弱毒株PCR结果冲突(13株弱毒株呈mrp阴性)，说明该基因序列可能存在多样性。本研究通过比对不同菌株中mrp序列，鉴定其保守区和高变区，并分别设计引物(mrp-1、mrp-2)，检测不同SS2菌株的mrp基因型。分析发现，mrp基因在SS2菌株中广泛分布，但其序列存在差异。通过斑马鱼感染模型检测毒力，发现mrp-A型(mrp-1+/mrp-2+)菌株比B型(mrp-1+/mrp-2-)菌株毒力强;且实时荧光定量PCR结果表明A型菌株的mrp转录水平更高。
　　4猪链球菌2型pnuC基因缺失株的构建及致病性分析
　　比较10株强毒株和Ⅱ组弱毒株（7株菌）的core-genome，发现了强毒株特有的53个基因，包括位于同一操纵子上的nadR，pnuC和mutT基因。我们以猪链球菌2型强毒株ZY05719为研究对象，采用融合PCR和同源重组方法，使用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET-4S成功构建了pnuC基因缺失株△pnuC。通过斑马鱼模型，评价野生株ZY05719与缺失株△pnuC毒力水平，发现缺失株对斑马鱼的致病力相对于野生株明显降低。说明pnuC基因对SS2致病性的发挥具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 猪链球菌2型毒力因子及研究方法进展

1 猪链球菌2型主要毒力因子

1．1 荚膜多糖

1．2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子

1．3 溶血素

1．4 纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白

1．5 谷氨酸脱氢酶

1．6 3-磷酸甘油醛脱氢酶

1．7 其他毒力因子

2 组学方法在猪链球菌研究中的应用

2．1 基因组学

2．2 蛋白质组学

2．3 转录组学

3 猪链球菌感染动物模型

3．1 猪模型

3．2 小鼠模型

3．3 斑马鱼模型

3．4 其他动物模型

参考文献

第二章 猪链球菌2型弱毒菌株的筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 细菌培养条件及DNA提取

1．3 SS2菌株基因型的确定

1．4 SS2菌株毒力检测

2 结果

2．1 SS2菌株的基因型

2．2 SS2菌株LD50

2．3 SS2菌株毒力水平

3 讨论

参考文献

第三章 猪链球菌2型Pan-genome分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 猪链球菌2型菌株基因组提取及测序

1．3 猪链球菌2型基因聚类分析

1．4 猪链球菌2型进化关系分析

1．5 猪链球菌2型pan-genome和core-genome分析

1．6 猪链球菌2型MLST分型

1．7 猪链球菌2型菌毛分型

1．8 (前)噬菌体预测

1．9 毒力相关基因在SS2基因组中的同源性分析

2 结果

2．1 猪链球菌2型菌株测序结果

2．2 猪链球菌2型进化关系

2．3 猪链球菌2型COG功能分析

2．4 猪链球菌2型pan-genome

2．4 猪链球菌2型core-genome

2．5 强、弱毒株核心基因组的比较

2．6 猪链球菌2型MLST分型

2．7 猪链球菌2型菌毛分型

2．8 (前)噬菌体序列

2．9 毒力相关基因mrp，epf，sly在不同SS2中的同源性

3 讨论

参考文献

第四章 mrp基因型与猪链球菌2型菌株毒力的关系

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 不同SS2菌株中mrp基因同源性分析

1．3 PCR检测mrp基因在SS2菌株中的分布

1．4 不同mrp基因型菌株毒力水平的测定

1．5 细菌总RNA的提取及反转录

1．6 不同mrp基因型菌株中mrp转录水平的测定

2 结果

2．1 不同SS2菌株中mrp基因同源性

2．2 mrp基因在SS2菌株中的分布

2．3 不同mrp基因型菌株的毒力水平

2．4 统计分析SS2菌株毒力水平

2．5 不同mrp基因型菌株中mrp转录水平

3 讨论

参考文献

第五章 猪链球菌2型pnuC基因缺失株的构建及致病性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 pnuC基因生物信息学分析

1．3 pnuC基因在SS2菌株中的分布

1．4 pnuC基因缺失株的构建

1．5 斑马鱼毒力实验

2 结果

2．1 pnuC基因生物信息学分析

2．2 pnuC基因在SS2菌株中的分布

2．3 缺失重组质粒的构建

2．4 pnuC基因缺失株的筛选

2．5 缺失株与野生株毒力比较

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

发表与待发表文章