猪链球菌2型的毒力基因分群及毒力群的特征分析

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种对养猪产业危害严重的重要细菌性病原，在全球范围内都造成了重大的经济损失。猪链球菌病的主要发病表现有脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎和急性败血症死亡等。它同时也是一种重要的人畜共患病病原，中国在1998年及2005年都曾出现严重的人感染猪链球菌事件。根据其荚膜多糖抗原的不同，猪链球菌至少可分为29个血清型，其中猪链球菌2型(Streptococcus suisseretype2，SS2)流行性最广，致病力最强。对猪链球菌2型毒力相关的研究，可为进一步了解猪链球菌病的致病机制以及防控该类疫病提供理论依据。
　　本试验对本实验室自1998年来分离保存的357株猪链球菌菌株，通过猪链球菌2型的血清型特异性PCR检测体系与猪链球菌2型血清凝集试验，从中筛选出101株血清型2型菌株。综合文献选取了猪链球菌2型的22种毒力因子基因（包括mrp，epfsly,fbps, rgg, of,srtA, pgdA, gapdh, iga, endoD, eiaRH, salKR, manN, purD,rgg，dppⅣ, neuB，dltA，comR和permease）作为毒力基因差异性分布分析的靶基因，分别设计了这22种毒力基因的检测引物，检测了以上22种毒力基因在101株猪链球菌2型的分布，并且根据得到的毒力因子谱进行了聚类分析。毒力因子聚类分析结果表明，101株猪链球菌2型菌株可被分为两个毒力群，即A群（14株）与B群(87株)。统计分析表明epf, sly，rgg，endoD，comR和permease在B群中的分布率要显著高于A群。根据毒力基因差异性分布的结果，我们推测B群可能比A群有更强的毒力。
　　为验证以上假设，我们从A群和B群中随机选出了部分菌株（挑选比率为A群3/14，B群7/87），分别以斑马鱼和BALB/c小鼠为动物模型评估其毒力水平。在斑马鱼动物模型上，所挑选菌株的攻毒剂量为1.0×107，1.0×106和1.0×105 CFU/尾，以腹腔注射的方式进行攻毒。攻毒结果表明B群菌株在三个攻毒梯度上都显示出了比A群菌株更高的毒力水平，而且在1.0×105 CFU/尾的梯度上毒力差异尤为显著。BALB/c小鼠动物模型各菌株的攻毒剂量为1.0×109，2.0×108和4.0×107 CFU/只，以腹腔注射的方式进行攻毒。除菌株JX081202外，另外6株B群菌株均在BALB/c小鼠攻毒模型上被鉴定为强毒，而3株A群菌株则被鉴定为弱毒。以上斑马鱼与BALB/c小鼠动物攻毒试验的结果均证实了我们的推测，即B群具有比A群有更强的毒力。毒力基因ep，sly，rgg，endoD，comR和permease在A群与B群中分布存在显著差异，由于comR在A菌株中是突变体，另外5个基因具有成为毒力标志基因的潜力。同时我们也注意到，毒力基因srtA，gdh，pgdA，gapdh，iga，ciaRH，manN，purD，dppⅣ, ofs，fbps，SspA，neuB以及dltA在A群和B群中均有较高分布。针对以上14种毒力基因，我们设计了qRT-PCR引物，并对其转录水平进行了检测。结果显示neuB，ditA，fbps和pgdA在B群菌株中的表达量要显著高于A群菌株。因此，本研究进一步证实了猪链球菌2型存在不同的毒力群，在不同的毒力群间部分毒力基因的分布和表达具差异性，在一定程度上解释了强毒株与弱毒株毒力水平的差异，为猪链球菌的毒力研究提供了一个新的视角。更重要的是，我们提出的潜在的毒力标志基因，在猪链球菌2型菌株的毒力鉴定中有应用价值，可能会对猪链球菌病的预防控制有所帮助。

目录

声明

摘要

第一章 猪链球菌病简述

1 猪链球菌病的流行病学研究

2 猪链球菌的毒力因子研究

2．1 溶血素

2．2 荚膜多糖

2．3 溶菌酶释放蛋白和细菌胞壁蛋白胞外因子

2．4 枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶

2．5 甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2．6 纤连蛋白结合蛋白

2．7 Rgg蛋白

2．8 血清浑浊因子

2．9 转肽酶A

2．10 肽聚糖N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶

2．11 唾液酸合成酶

2．13 IgA1蛋白酶

2．14 二元调控系统CiaRH

2．15 二元调控系统SalKR

2．16 二肽基肽酶Ⅳ

2．17 其他猪链球菌毒力因子

3 猪链球菌的基因分型方法

3．1 脉冲场凝胶电泳

3．2 多位点序列分型

3．3 毒力基因分型

第二章 猪链球菌2型毒力基因检测与分群

1 材料与方法

1．1 菌株来源及鉴定

1．2 主要试剂和仪器

1．3 细菌培养与基因组提取

1．4 毒力基因引物设计

1．6 毒力基因PCR反应条件

1．5 毒力基因数据的聚类分析

2 结果与分析

2．1 菌株的血清型鉴定

2．2 引物设计

2．3 PCR检测毒力基因与聚类分群结果

2．4 不同毒力群间毒力基因分布比较

2．5 基因组差异毒力基因区域分析

3 讨论

第三章 猪链球菌2型毒力群的毒力水平评价

1 材料与方法

1．1 菌株准备

1．2 主要试剂和仪器

1．3 斑马鱼模型攻毒试验

1．4 小鼠模型攻毒试验

2 结果与分析

2．1 斑马鱼模型攻毒试验结果

2．2 小鼠模型攻毒试验结果

2．3 攻毒结果统计学分析

3 讨论

第四章 猪链球菌毒力基因转录水平检测

1．1 菌株准备

1．2 主要试剂和仪器

1．3 细菌RNA的提取与cDNA的合成

1．4 荧光定量PCR

2 结果与分析

2．1 荧光定量PCR引物设计

2．1 毒力基因转录水平检测结果

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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