兔波氏杆菌灭活苗佐剂筛选及免疫效果的研究

摘要

兔支气管败血波氏杆菌(Bb)是引起家兔慢性呼吸道疾病的主要病原，其致病病程长，难治愈，是严重影响兔产业的重要疾病，临床上有该菌感染人的报道。目前，该病的疫苗还处于实验室研究阶段、保护率较低，开展高效的支气管败血波氏杆菌疫苗研究佐剂，提高疫苗对兔机体的保护效果，对改善兔产业体系健康发展及公共卫生安全具有重要意义。本研究对不同的佐剂进行了筛选，对筛选出的新型佐剂苗木鳖子提取物(ECMS)+油佐剂苗与常规油佐剂苗及无佐剂苗进行了比较研究，对新型佐剂进行了免疫增强作用的研究，新型佐剂苗不仅提高动物机体的体液免疫而且提高了其细胞免疫水平。本研究为兔波氏杆菌疫苗的研发提供了技术依据，同时也为兽用新型疫苗的开发提供了新的思路。
　　1.兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA检测方法的优化
　　以兔Bb全菌蛋白包被酶标板，建立了Bb间接ELISA检测方法。优化的结果为:全菌蛋白(1μg/ml)37℃包被2h;封闭液为5％的脱脂乳，37℃作用2h;血清以1∶400稀释后37℃作用1h;二抗(1∶5000)37℃作用75 min;显色条件为37℃避光作用10 min。阴阳性临界值为0.19。该方法以其高敏感性、稳定性以及高度的特异性，为波氏杆菌的抗体检测提供了可靠的技术手段。
　　2.兔支气管败血波氏杆菌病灭活苗佐剂的筛选
　　本研究在波氏杆菌灭活苗中添加了不同剂量的ECMS，不同剂量ECMS+油，以及常规的矿物油和铝胶佐剂，以上疫苗免疫家兔后不同时间采集血清，以不同蛋白作为包被抗原检测血清抗体IgG，同时检测血清中IL-2的含量等，攻毒前采集全血，MTT试验检测家兔的细胞免疫状态，最后进行攻毒感染检测疫苗保护率。结果显示ECMS800+油组的抗全菌蛋白和外膜孔蛋白前体(PPP)抗体水平均不同程度高于其他各组，细胞因子IL-2的含量较其他各组均有上升的趋势，ECMSS00+油组的淋巴细胞刺激指数在三种刺激物的刺激下均高于其他各组，两次的攻毒保护率均最高，分别为78％和100％。综上所述，比较筛选出ECMS800+油为最优佐剂。
　　3.ECMS800+oil对兔支气管败血波氏杆菌灭活苗免疫增强作用的研究
　　本试验用油佐剂苗及无佐剂苗作为对照，对筛选的ECMSS00+油苗进行免疫指标检测，对其免疫增强作用进行了初步探究。家兔免疫后，间接ELISA检测血清中IgG抗体水平、可溶性CD4(sCD4)及CD8分子(sCD8)含量以及器官粘膜中IgA抗体水乎;采集抗凝血MTT法检测淋巴细胞转化率、试剂盒检测淋巴细胞上清中细胞因子IL-2、IFN-γ的表达量、流式细胞法检测CD4+、CD8+型T细胞含量;无菌摘取脾脏荧光定量检测脾脏中IL-2、IL-6、IFN-γ等的表达量;气管粘膜及肺脏做石蜡切片检测IgA阳性细胞的含量;称取免疫兔脾脏和胸腺鲜重及活体重检测免疫器官指数;最后进行攻毒感染试验。结果ECMS800+油苗有效提高了家兔的体液免疫和细胞免疫水平，并达到了较好的粘膜免疫效果，疫苗保护率得到了明显的提高，激发了机体全面而持久的免疫反应。该佐剂的研究为波氏杆菌疫苗的研发提供了新方法。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 家兔波氏杆菌病研究进展

1．波氏杆菌致病因子的研究现状

2．波氏杆菌病疫苗的研究现状

3．免疫佐剂的研究进展

3．1 佐剂的作用机制

3．2 常见的免疫佐剂

3．3 免疫佐剂面临的挑战

参考文献

第二章 兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA检测方法的建立

1 材料

1．1 抗原与血清

1．2 主要试剂与仪器

2 方法

2．1 抗原与血清最佳浓度的确定

2．2 最佳包被时间的确定

2．3 封闭条件的优化

2．4 血清作用时间的优化

2．5 酶标二抗作用条件的优化

2．6 底物作用时间的优化

2．7 血清阴阳性临界值的确定

2．8 敏感性试验

2．9 特异性试验

2．10 重复性试验

3 结果

3．1 抗原抗体最佳浓度的确定

3．2 最佳包被时间的确定

3．3 封闭条件的优化

3．4 血清作用时间的优化

3．5 酶标二抗作用条件的优化

3．6 底物作用时间的优化

3．7 血清阴阳性临界值的确定

3．8 敏感性试验

3．9 特异性试验

3．10 重复性试验

4 讨论

参考文献

第三章 兔支气管败血波氏杆菌灭活苗佐剂的筛选

1．材料

1．1 试验动物

1．2 佐剂和抗原

1．3 主要试剂和仪器

2．方法

2．1 ECMS的制备

2．2 疫苗制备

2．3 凝集抗原的制备

2．4 动物分组与免疫处理

2．5 抗体检测

2．6 淋巴细胞转化试验

2．7 微量凝集抗体检测

2．8 血清中细胞因子IL-2的测定

2．9 攻毒保护率的测定

2．10 统计分析

3．结果

3．1 抗体水平检测

3．2 淋巴细胞转化试验

3．3 血清中细胞因子IL-2的测定

3．4 攻毒保护率的测定

3．5 全菌蛋白抗体检测结果

3．6 微量凝集检测抗体效价

3．7 间接ELISA与MAT的符合率

3．8 攻毒保护率的测定

4 讨论

参考文献

第四章 ECMS+oil对兔波氏杆菌灭活苗免疫增强作用的研究

1．材料

1．1 试验动物

1．2 佐剂与抗原

1．3 试剂和仪器

2 方法

2．1 灭活苗制备

2．2 动物分组及免疫处理

2．3 免疫抗体检测

2．4 淋巴细胞转化试验

2．5 细胞因子的测定

2．6 T淋巴细胞亚型的测定

2．7 免疫指数的测定

2．8 石蜡切片检测肺脏及气管IgA阳性细胞

2．9 攻毒保护率的测定

2．10 统计分析

3 结果

3．1 免疫抗体检测结果

3．2 淋巴细胞转化试验

3．3 细胞因子的测定结果

3．4 T淋巴细胞亚型的测定结果

3．5 免疫指数测定结果

3．6 肺脏及气管IgA阳性细胞的检测结果

3．7 攻毒保护率的测定

4 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

附录

致谢

硕士期间发表及待发表的文章