兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测用引物组和试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及家畜细菌病的诊断技术领域，尤其涉及用于兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测用引物组和试剂盒及其检测方法。该试剂盒包含7个冻存管，其中2个冻存管分别装有2×PCR核心试剂预混物，其它5个冻存管分别装有兔巴氏杆菌DNA溶液，波氏杆菌阳性DNA溶液，DL2000分子量标准溶液，ddH

说明书

技术领域

本发明涉及家畜细菌病的诊断技术领域，尤其涉及用于兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测用引物组和试剂盒及其检测方法。

背景技术

兔巴氏杆菌病（RabbitPasteurellosis）是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）引起的一种人兽共患的多型性传染病。兔巴氏杆菌病可以根据感染部位的不同分为：鼻炎型、流行性肺炎、败血症、子宫积脓、辜丸炎、中耳炎和结膜炎等。兔巴氏杆菌病的急性暴发会造成兔群的大批死亡，慢性感染会由于无法根治造成病情反复，或出现混合感染，无法根治，给养兔业带来经济损失，被列为重点防治的家兔疫病之一。兔波氏杆菌病是由波氏杆菌（Bordetellabornchispetica,Bb）引起的一种多发性呼吸道疾病，主要引起哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等，部分兔场波氏杆菌感染率高达70%。近年来在我省乃至我国各养兔地区波氏杆菌发病日趋严重，是引起家兔呼吸系统疾病的最主要病原，该病病程长，反复发生，难治愈，易造成患兔生长障碍，饲料利用率低，给养兔业带来了很大的经济损失。此外，机体感染该菌后，往往容易继发或并发感染其他细菌和病毒，导致更严重的呼吸道疾病，带来更加严重的损失。并且也可感染人，尤其是免疫力低下的人群。兔巴氏杆菌病与兔波氏杆菌病经常混合感染，且二者在临床症状、病理变化及流行病学等方面都存在诸多相似的地方，常规的诊断方法很难快速、准确地作出诊断，且容易造成误诊，贻误疾病的治疗。因此建立一种鉴别诊断兔支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌及两种疾病混合感染的检测方法十分必要。

目前,在病原体检测方面主要检测方法有形态学观察、免疫学检测和核酸检测。兔巴氏杆菌的血清型多达16种，一般实验室很难拥有全部参考血清，而血清学检测时又会出现交叉反应。常用的阳性血清平板凝集法，需制备阳性血清，而且只能检测特定血清型的巴氏杆菌。相反PCR检测方法快速、高效、特异性和灵敏度高，能够在较短时间内得到检测结果，诊断效率高，不需要纯培养，只需从病料中提取DNA，利用特异性引扩增目的片段做出诊断。兔波氏杆菌病的诊断主要还是依靠普通细菌学检测方法，进行各项生化指标的鉴定，动物回归试验等，传统的细菌学诊断方法，繁琐费时，检出率低，且检测工作量大，效率不大。血清学诊断方法主要集中在乳胶凝集试验、微量凝集试验、Dot-ELISA和间接ELISA，郭明璋、董亚芳等于1994年进行了兔波氏杆菌抗体ELISA检测方法的研究，在敏感性和特异性上都有很大提高,操作相对简单,但存在空窗期、交叉反应等问题。间接ELISA主要是以使用全菌体或超声抗原作为抗原，有其局限性，只能测出同种血清型的抗体。核酸检测是一种较理想的病原学检测方法,PCR及其衍生技术在敏感性及特异性上均表现良好。兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测可用于兔巴氏杆菌和兔波氏杆菌感染的快速鉴别诊断和流行病学调查，具有十分重要的意义，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医及进出口检验检疫等等领域应用前景广阔。

经过对现有技术的文献检索未发现兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法相关研究报道，因此研制兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测试剂盒十分必要。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种兔巴氏杆菌、波氏杆菌多重PCR检测试用引物组，本发明的第二个目的是提供一种兔巴氏杆菌、波氏杆菌多重PCR检测试剂盒，本发明的第三个目的是提供一种兔巴氏杆菌、波氏杆菌多重PCR检测检测方法。采用该试剂盒和检测方法具有操作简单、灵敏度高的特点。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案。

兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR 检测用引物组，该引物组由两对引物对组成，两对引物对如下所示：

兔巴氏杆菌引物：

5’GAGTCTAGAGTACTTTAGGGA 3’

5’ACTTTCTGAGATTCGCTC 3’；

兔波氏杆菌引物：

5’TGAACAATGGCGTGAAAG 3’

5’TCGATAGTAGGACGGGAGG 3’。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案。

兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR 检测用试剂盒，该试剂盒包括兔巴氏杆菌、波氏杆菌阳性对照DNA，2×PCR核心试剂预混物，DL2000分子量标准溶液， ddH₂O，上述的兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR 检测用引物组。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案。

兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR 检测方法，该方法包括以下的步骤：

（一）提供待测样品DNA；

（二）采用上述的兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR 检测用试剂盒，多重PCR方法扩增待测样品的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增结果，根据结果进行判定；以兔巴氏杆菌、波氏杆菌阳性DNA作为对照，若对照未扩增出以下全部条带，则重新检测；若对照扩增出以下全部条带，则结果判定如下：

若扩增片段大小为644bp，为兔巴氏杆菌阳性；

若扩增片段大小为425bp，为兔波氏杆菌阳性；

若同时扩增644bp、425bp，则为兔巴氏杆菌、波氏杆菌混合感染。

作为优选，上述PCR扩增参数具体为：95℃ 5min, 95℃ 30s, 60℃ 30s,72℃30s,36个循环，72℃ 10min。

与现有的技术相比，本发明的有益效果。

1、该多重PCR方法操作简单，具有良好的特异性，对同种细菌的不同菌株具有广泛的适用性。

2、具有较高的灵敏度，可以检出痕量级的模板兔巴氏杆菌最低模板检出量为6×101cfu，波氏杆菌最低模板检出量为4×102cfu。

3、该多重PCR可以同时兔巴氏杆菌、波氏杆菌进行鉴别诊断，与单PCR相比更快速、经济。

附图说明

图1为多重PCR敏感性检测结果图；M：DNA分子质量标准；1～7分别表示不同稀释度的巴氏杆菌和波氏杆菌菌液为模板的双重PCR扩增结果，其中细菌数分别为：1、6×10⁶；2、6×10⁵；3、6×10⁴；4、6×10³；5、6×10²；6、6；7、0.8。

图2为多重PCR敏感性检测结果图；M：DNA分子质量标准；1～7分别表示不同稀释度的巴氏杆菌和波氏杆菌菌液为模板的双重PCR扩增结果，其中细菌数分别为：1、4×10⁶；2、4×10⁵；3、4×10⁴；4、4×10³；5、4×10²；6、4。

图3为多重PCR特异性检测结果图M：DNA分子质量标准；1、巴氏杆菌和波氏杆菌的混合培养物；2、巴氏杆菌；3、波氏杆菌；4、沙门氏菌；5、大肠杆菌；6、魏氏梭菌；7、葡萄球菌；8、双蒸水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例涉及的试剂盒及检测方法如下。

1、            试剂盒

本实施例的多重PCR检测试剂盒，包括7个冻存管、50个PCR反应管和说明书。7个冻存管分别为：代号冻存管A（2个）装有2×PCR核心试剂预混物（Taq酶、dNTPs混合物和MgCl₂溶液，市购），冻存管B和C分别装有50ul兔巴氏杆菌、波氏杆菌阳性DNA溶液，冻存管D装有0.5mlDL2000分子量标准溶液（市购），冻存管E装有1.5mlddH₂O,冻存管F装有PCR体系所用引物混合物，兔巴氏杆菌引物：5’GAGTCTAGAGTACTTTAGGGA 3’、5’ACTTTCTGAGATTCGCTC 3’；兔波氏杆菌引物：5’TGAACAATGGCGTGAAAG 3’、5’ TCGATAGTAGGACGGGAGG 3’；所有冻存管均保存于-20℃。

2、            试剂盒的检测方法

步骤一，取冻存管A溶液12.5ul分别加入PCR反应管中，加入引物溶液2ul，做好标记后，立即加入待测样品DNA模板，用冻存管E中的ddH2O调终体积至25ul,混合均匀后进行检测；阳性对照相同操作，加入冻存管B和C巴氏杆菌、波氏杆菌阳性DNA溶液各1ul；阴性对照不加模板，dH2O调终体积至25ul；

步骤二，将PCR反应管放置在PCR仪上进行扩增：首先95℃5min,95℃30s,60℃30s,72℃30s,36个循环；72℃延伸10min；

步骤三，将扩增后的产物在110v电压下进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物和冻存管D中DL2000分子量标准溶液的点样量为8ul每孔，电泳时间30min，电泳完毕后用凝胶成像分析；

步骤四，结果判定：

（1）若阳性对照扩增片段大小为644bp，兔波氏杆菌阳性扩增片段大小为425bp，阴性对照结果为阴性，则多重PCR体系结果判定如下：

若待测样品扩增出644bp条带，则为兔巴氏杆菌；

若待测样品扩增出425bp条带，则为兔波氏氏杆菌；

无对应条带或条带大小不吻合，则判断结果为阴性；

（2）若阳性对照未扩增出全部条带或阴性对照出现阳性目的条带，需重新检测并判定。

实施例2

本案例涉及的材料如下：兔源巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、魏氏梭菌菌参考菌株均购自中国兽药监察所。

将上述菌种接种于2ml增菌肉汤培养基，37℃培养过夜，然后进行以下试验：

1、敏感性试验

将37℃摇床过夜的巴氏杆菌和波氏杆菌菌液进行10倍系列稀释，进行平板计数后进行多重PCR反应以检测敏感性，结果如图1、图2所示，

2、特异性试验

兔巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、魏氏梭菌等复苏培养后，提取DNA进行特异性试验。结果如图3所示。 

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌多重PCR检测用引物组和试剂盒及其检测方法

<160>4

 

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物

<400>1

GAGTCTAGAGTACTTTAGGGA 21

 

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物

<400>2

ACTTTCTGAGATTCGCTC 18

 

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物

<400>3

TGAACAATGGCGTGAAAG 18

 

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物

<400>4

TCGATAGTAGGACGGGAGG 19