牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌多重PCR-ELISA检测方法的建立及初步应用

摘要

近年来;牛呼吸系统疾病（bovine respiratory disease;BRD）已成为危害我国肉牛养殖业的主要疾病之一;尤其是在我国“北牛南调;西牛东运”的肉牛育肥模式下;该病的发生和传播更为普遍。据统计;经长途运输的育肥架子牛;有60%左右会发生 BRD。BRD 主要由牛支原体（Mycoplasma bovis;M.bovis）、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella mutocida;Pm）和牛溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica;Mh）引发;部分病例为混合感染。同时;上述病原均为苛养菌;且对常用药物敏感性不同;尤其是牛支原体;不但分离培养周期长;还对兽医临床常用的β-内酰胺类抗生素具有天然抗性;如不能正确做出诊断;就会造成较大经济损失。为此;研发一种可快速、准确鉴定BRD主要病原的方法;已迫在眉睫。 其中;PCR-ELISA方法是PCR反应与地高辛检测系统的结合;已普遍用于食品及病原微生物的快速检测;受到了相关学者和基层工作者的青睐。该方法主要是将PCR引物标记地高辛、探针标记生物素并将链霉亲和素结合在ELISA板上;利用生物素与亲和素的高亲和力;将杂交产物固定在 ELISA 板上;加入酶的相应底物;根据显色反应或酶标仪读取数据判定结果。该方法可实现同时对多种病原体进行定性检测;具有快速、操作简便等特点。为此;本研究利用探针引物双标记法建立了同时检测BRD三种主要病原体的多重PCR-ELISA检测方法。具体实验结果如下： （1）种间特异性基因的筛选 将目标菌株的全基因组序列与NCBI的动物nt库以及细菌nt库（去除了目标菌种序列）进行比较;对没有比对到数据库的序列进行筛选;进一步采用orthomcl对目的基因进行聚类分析;最终得到667组牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性基因;380组溶血曼氏杆菌特异性基因。 （2）多重PCR检测方法的建立 根据筛选出的种间 特异性基因;建立多重PCR检测方法;对引物条件、退火温度、循环数等进行优化;最终筛选出三对特异性引物;退火温度为54.5℃;最佳循环次数为 30。多重 PCR 的灵敏度 Pm 为 6.8×103CFU/mL、Mh 为3.7×104CFU/mL、M.bovis为1.1×106CFU/mL。 （3）多重PCR-ELISA检测方法的建立 采用化学变性杂交法建立多重PCR-ELISA检测方法;并对条件进行优化; 结果显示;包被液（链霉亲和素）浓度为5μg/mL;封闭液（BSA）浓度为0.5%;封闭时间为20min;过氧化物酶标记的抗地高辛抗体稀释 1000 倍;显色时间为20min;探针浓度为0.5mmol/10mL时;该检测方法灵敏度Pm为6.8×101CFU/mL、Mh 为3.7×103CFU/mL、M.bovis为1.1×104CFU/mL。

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