石耳子实体多糖的分离纯化、结构解析及生物活性研究

摘要

石耳（Umbilicaria），是一种食药兼用的真菌和藻类的共生体。其药用价值很高，而其多糖作为一种活性物质，具有很强的抗癌，抗血栓活性，能增强机体的免疫能力。目前国内外对石耳多糖(UPS)的研究报道较少，对其分离纯化及结构方面的研究更是不够全面。本文主要研究了石耳多糖的最佳提取条件，经分离纯化得到石耳多糖纯品，并对其结构进行表征和体外抗氧化活性进行初探。
　　首先对石耳多糖的提取工艺进行了研究。选取提取温度50～90℃、提取时间1～5h、提取水料比5∶1～25∶1 ml/mg和提取次数1～5次分别进行单因素实验，最后选择前三种因素利用Design-Expert软件进行响应曲面分析，结合实际操作，得到石耳多糖的最佳理论提取工艺为:提取温度为84.83℃，提取时间为3.56 h，提取水料比为20.64∶1mL/g，石耳多糖提取得率为13.37％。
　　然后将提取出的石耳粗多糖进行分离纯化后测定其基本理化性质。利用DEAE-纤维素-52离子交换柱对石耳粗多糖进行初步分离纯化，得到两个组分UPS-1和UPS-2，得率分别为49.05％和23.23％。再利用葡聚糖凝胶G-150对UPS-1和UPS-2进一步纯化，得到两个组分UPS-1-1和UPS-2-1，得率分别为42.17％和42.6％。
　　对石耳粗多糖UPS及分离纯化后的UPS-1-1和UPS-2-1进行基本理化性质分析，总糖含量分别为43.68％，55.12％和53.34％;蛋白质含量分别为1.01％，0.31％和0.28％;硫酸基含量分别为2.38％，4.07％和5.02％;糖醛酸含量分别为6.50％，19.29％和19.50％。
　　对石耳多糖的两个纯化组分做结构鉴定。利用高效体积排阻色谱法(HPSEC)检测其相对分子量和纯度，结果表明，UPS-1-1和UPS-2-1两个组分都是单一组分，分子量分别是124.7 kD和249.4 kD。
　　对石耳多糖的两个纯化组分进行衍生化后利用高效液相色谱法(HPLC)分析其单糖组成。UPS-1-1的单糖组成及摩尔百分比为甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖=0.59∶3.12∶93.09∶3.03;UPS-2-1的单糖组成及摩尔百分比为甘露糖∶葡萄糖=20.66∶79.34。
　　利用溴化钾压片法对石耳多糖的两个纯化组分进行红外光谱分析。结果发现，这两个组分在4000 cm-1～400 cm-1范围内呈现典型的多糖吸收峰，说明检测样品都是多糖类物质，其中含有硫酸和羧酸基团。
　　运用扫描电镜观察石耳多糖两个纯化组分的表面形貌，结果发现，UPS-1-1和UPS-2-1在高倍镜下表面平整较为光滑，说明分子间作用力强。利用原子力显微镜观察多糖纯化组分的形态，结果显示，这两个组分均为多个糖链的聚集体，而非单个糖链。
　　对石耳粗多糖和两个纯化组分的抗氧化活性进行初步研究。运用化学方法分别测量分析了石耳粗多糖(UPS)，两个纯化组分（UPS-1-1和UPS-2-1）的体外抗氧化活性。结果表明:三者还原力较弱，但它们体外能够清除羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)，具有一定的抗氧化活性。UPS-2-1比粗多糖UPS和UPS-1-1具有更高的体外抗氧化活性。

目录

声明

摘要

表格索引

图形索引

第一章 文献综述

1 多糖的研究进展

1．1 概述

1．2 多糖提取

1．3 多糖的分离与纯化

1．4 多糖的纯化和与分级分离

1．5 多糖含量测定

1．6 多糖结构的鉴定

1．7 多糖的抗氧化活性研究

2．石耳多糖的研究进展

2．1 石耳简介

2．2 石耳化学成分

2．3 石耳多糖的提取方法

2．4 石耳多糖的分离纯化及结构鉴定

2．5 石耳多糖的活性研究

3 本文研究的目的意义与主要内容

3．1 目的意义

3．2 主要内容

参考文献

第二章 石耳多糖提取工艺的研究与优化

1 材料与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 仪器与设备

2 实验方法

2．1 石耳多糖的提取工艺流程

2．2 试验设计

2．3 石耳多糖得率计算

2．4 数据统计方法

3 结果与分析

3．1 水提醇沉法制取石耳多糖的单因素影响

3．2 响应曲面法试验结果与分析

3．3 回归模型的试验验证

4 本章小结

参考文献

第三章 石耳多糖的分离纯化及其理化性质的测定

1 材料与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 仪器与设备

2 实验方法

2．1 DEAE-cellulos-52阴离子交换色谱初步分离

2．2 葡聚糖凝胶色谱法进一步分离纯化

2．3 石耳多糖及多糖纯品的基本理化分析

3 结果与讨论

3．1 石耳粗多糖的DEAE-纤维素阴离子交换色谱法初步分离

3．2 石耳多糖初步纯化产品的葡聚糖凝胶法进一步纯化

3．3 石耳多糖中总糖含量

3．4 石耳多糖中蛋白质含量

3．5 石耳多糖中硫酸基含量的测定

3．6 石耳多糖中糖醛酸含量的测定

4 本章小结

参考文献

第四章 石耳多糖的结构解析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验方法

2 结果与讨论

2．1 石耳多糖的分子量和纯度

2．2 石耳多糖的单糖组成

2．3 石耳多糖的红外光谱扫描

2．4 石耳多糖的扫描电镜(SEM)观察

2．5 原子力显微镜(AFM)对石耳多糖的观察

3 本章小结

参考文献

第五章 石耳多糖抗氧化活性研究

1 材料与仪器

1．1 实验材料与试剂

1．2 仪器与设备

2 实验方法

2．1 还原力的测定

2．2 清除羟自由基的作用

2．3 清除超氧阴离子(O2-·)自由基的作用

3 结果与分析

3．1 还原力的测定

3．2 对羟自由基(·OH)的清除作用

3．3 对超氧阴离子(O2-·)的清除作用

4 本章小结

参考文献

结论和展望

1 结论

2 展望

论文创新点

致谢

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