灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1与水稻条纹病毒的互作

摘要

灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén(small brown planthopper，SBPH)是水稻重要害虫之一，不仅以刺吸方式取食水稻，并且传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)引起条纹叶枯病的暴发和流行，给水稻生产造成严重的经济损失。1992年日本研究人员从灰飞虱种群中首次分离出Himetobi P病毒(Himetobi P virus，HiPV)，HiPV是一种感染稻飞虱的类似ssRNA的昆虫病毒，属于蟋蟀麻痹病毒属（Cripavirus）。前期研究发现，RSV核糖核蛋白(RNP)可以与HiPV VP1蛋白互作，表明VP1蛋白可能参与灰飞虱对RSV的传播。为此，本论文围绕HiPV VP1与RSV的关系展开研究。
　　一、灰飞虱江苏种群HiPV基因组全序列的测定与分析
　　测定灰飞虱江苏种群（Q群体）HiPV基因组全序列，并与已报道的日本、浙江和江苏灰飞虱种群HiPV基因组全序列以及日本褐飞虱种群HiPV基因组全序列进行同源性分析，这5个HiPV分离物表现出很高的同源性，Q群体分离物与其他4个种群分离物的核酸序列同源性分别是98.8％、99.5％、99.7％和98.4％。
　　二、带毒(RSV)灰飞虱与体内感染HiPV之间相关性分析
　　在获得灰飞虱江苏种群HiPV基因组全序列的基础上，设计特异引物，通过qRT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV-RNP和HiPV-VP1的表达量关系。结果显示，不同灰飞虱体内具有不同的RSV和HiPV病毒量，并且两者呈正相关关系;Hi PV-VP1表达量高的灰飞虱体内RSV-RNP积累量也高，HiPV-VP1表达量较低的灰飞虱体内RSV-RNP积累量相对低;且大部分RSV高积累量的灰飞虱群体中，体内均含高量的HiPV-VP1，暗示灰飞虱体内HiPV-VP1可能会影响RSV的复制表达。
　　三、HiPV对灰飞虱体内RSV的积累以及获毒(RSV)能力的影响分析
　　利用RNAi技术，以HiPV-VP1基因为靶序列合成ds VP1，通过饲喂法，研究灰飞虱体肉RSV复制和获毒(RSV)能力的影响。结果发现，通过喂食有毒灰飞虱dsVP1后，HiPV-VP1表达受到抑制时，RSV-RNP的积累量同样受到抑制，证明HiPV-VP1可以促进RSV病毒在灰飞虱体内的积累;而饲喂无毒(RSV)灰飞虱dsVP1后，进行饲毒实验，潜伏期后检测获毒率发现，抑制HiPV-VP1后灰飞虱对 RSV的获毒率无显著影响。
　　四、灰飞虱体内HiPV-VP1互作蛋白的筛选及分析
　　构建诱饵蛋白酵母双杂交载体pGBKT7-VP1后，使用酵母双杂交系统在灰飞虱cDNA文库中筛选VP1的互作蛋白，最后获得10个VP1互作因子，其中至少有3个基因的ORF是完整的。筛选得到的这些互作蛋白因子，为进一步研究HiPV-VP1与灰飞虱之间的相互作用提供新的研究思路，为分析HiPV-VP1促进RSV在灰飞虱体内积累的相关机制提供理论基础，具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 RSV研究概况

1．1 RSV的危害和基本情况介绍

1．2 RSV的防治策略及其研究动态

2 RSV的传播介体灰飞虱及其传毒特性

2．1 灰飞虱的特点

2．2 灰飞虱的获毒、传毒能力

2．3 RSV与灰飞虱亲和性互作研究进展

3 灰飞虱体内病毒及其它共生微生物

3．1 灰飞虱体内共生微生物的研究

3．2 蟋蟀麻痹病毒属简介

3．3 Himetobi Pvirus病毒的基因组结构和研究

4 RNA干扰技术的研究及应用

4．1 RNA干扰

4．2 RNA干扰在昆虫及病毒领域的应用

5 本研究的目的和意义

第二章 灰飞虱江苏种群HiPV基因组全序列的测定与分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 灰飞虱江苏种群HiPV基因组全序列的测定及分析

2．2 基因组进化分析

3 讨论

第三章 带毒(RSV)灰飞虱与体内感染HiPV之间相关性分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫的筛选

1．2 实验方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 HiPV对灰飞虱体内RSV的积累以及获毒(RSV)能力的影响分析

1 材料与方法

1．1 供试虫体

1．2 总RNA提取和cDNA合成

1．3 dsRNA合成

1．4 dsRNA饲喂实验

1．5 灰飞虱体内RSV积累实验

1．6 灰飞虱获毒实验

2 结果与分析

2．1 RNA干扰后带毒灰飞虱体内RSV积累分析

2．2 RNA干扰后无毒灰飞虱获毒(RSV)分析

3 讨论

第五章 利用酵母双杂交系统以HiPV-VP1为诱饵筛选灰飞虱cDNA文库

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 pGBKT7-VP 1载体构建

2．2 诱饵质粒的毒性实验和自激活实验

2．3 筛选阳性酵母菌株

2．4 PCR验证插入片段大小

3 小结与讨论

全文总结

参考文献

附录 常用试剂配方

攻读硕士期间发表的文章

攻读硕士期间获得的奖励

致谢