巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力

摘要

鸡球虫病是由细胞内寄生的原虫——艾美耳属球虫(Eimeria)引起的全球性兽医卫生问题。鸡球虫病导致鸡群体重增长缓慢，料肉比降低和高死亡率，给养殖户收益和市场上的禽肉供给带来了巨大损害。目前世界上得到普遍公认的鸡球虫种有七个，其中E.acervulina、E.nectrix、E.maxima和E.tenella最普发。鸡艾美耳球虫在鸡肠道内寄生的部位体现出高度的特异性，比较典型的有E.acervulina主要寄生于十二指肠，E.maxima主要寄生于空肠，E.tenella主要寄生于盲肠，而E.brunetti则主要寄生于直肠。已有研究指出E.tenella微线蛋白3(EtMIC3)是决定E.tenella寄生于盲肠的关键分子，然而决定E.maxima寄生部位的关键分子尚未见报道。因此研究E.maxima与鸡空肠上皮细胞之间互作的分子机制有利于更深入的掌握E.maxima入侵的分子机制也有助于制定防控鸡球虫感染的策略。本研究鉴定了鸡空肠上皮细胞E.maxima子孢子结合蛋白，并选取四种E.maxima微线蛋白进行克隆、表达并评价其免疫保护力，旨在阐明决定E.maxima入侵部位特异性的关键分子，并为研发新型抗E.maxima疫苗筛选理想的候选抗原。
　　1.巨型艾美耳球虫子孢子空肠上皮细胞结合蛋白的鉴定
　　本研究旨在鉴定E.maxima子孢子空肠上皮细胞结合蛋白并分析其蛋白功能。应用免疫共沉淀方法收集E.maxima子孢子空肠上皮细胞结合蛋白，鸟枪测序法-液相色谱质谱/质谱联用(shotgun LC-MS/MS)对蛋白进行质谱鉴定并进行生物信息学分析。试验结果显示共有35种unique peptide count≥2的E.maxima子孢子蛋白被鉴定，其中包括入侵相关蛋白MIC2、MIC7和MIC3。生物信息学分析结果显示该35种蛋白均被成功注释，其中22种(62.86％)蛋白被预测有结合活性，15种(42.86％)蛋白被预测有催化活性。这些蛋白可能参与E.maxima入侵宿主细胞的过程以及宿主靶细胞的功能调节过程。本篇研究结果为我们进一步探明E.maxima和鸡空肠上皮细胞之间的相互作用提供基础，同时也为更好的阐释E.maxima致病的分子机理提供依据。
　　2.巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因的克隆、表达及免疫保护性研究
　　本章研究运用快速扩增cDNA末端(rapid-ampilification of cDNA ends，RACE)技术获得巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因(EmMIC3)的完整ORF。分别从主动免疫和被动免疫两方面评价重组MIC3蛋白(rEmMIC3)对E.maxima感染的免疫保护作用，并测定rEmMIC3免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖能力的变化。免疫保护试验结果显示rEmMIC3免疫组在空肠病变记分、OPG和相对增重方面均与各对照组的差异均显著(P＜0.05)，其ACI为186.02;被动免疫试验结果显示三个不同稀释浓度的大鼠抗rEmMIC3血清免疫相比于各对照组均能够显著减轻空肠病变，减少卵囊排出并提高相对增重率(P＜0.05)，且试验组的ACI均高于于183。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC3免疫鸡血清特异性抗体浓度在首免疫一周后得到显著提高，并在整个试验期间试验组特异性抗体浓度均显著高于对照组。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC3免疫能够显著上调血清细胞因子IL-2与IL-4(P＜0.05)。CCK-8试验结果表明rEmMIC3能够显著增强鸡脾脏淋巴细胞的增殖效应(P＜0.05)。综上结果表明EmMIC3基因免疫原性较好，能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，对E.maxima感染提供优秀的免疫保护力，可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。
　　3.巨型艾美耳球虫微线蛋白2基因的克隆、表达及免疫保护性研究
　　本章应用PCR技术扩增第三章鉴定的EmMIC2基因(FR718971.1)，构建了重组原核表达质粒pET-32a(+)-MIC2和真核表达质粒pVAX1-MIC2。动物免疫保护试验被应用于评估rEmMIC2和pVAX1-MIC2对E.maxima感染的免疫保护力，同时检测了rEmMIC2和pVAX1-MIC2免疫鸡血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖效应。免疫保护试验结果显示空肠病变记分、OPG和相对增重等指标方面，rEmMIC2和pVAX1-MIC2组与各对照组差异均显著(P＜0.05)，rEmMIC2组和pVAX1-MIC2组的ACI均大于165。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC2和pVAX1-MIC2均能在首次免疫一周后提高鸡体血清特异性抗体浓度，在加强免疫一周后特异性抗体水平达到最大值，并且均显著高于各对照组的特异性抗体水平(P＜0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC2和pVAX1-MIC2免疫均能引起鸡体产生更高水平的IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、 TGF-β与IL-4，且与对照组差异显著(P＜0.05）。MTT试验结果显示rEmMIC2和pVAX1-MIC2免疫鸡脾脏淋巴细胞增殖能力均显著高于对照组(P＜0.05)。上述结果表明EmMIC2免疫能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，具有中等的免疫保护性，可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。
　　4.巨型艾美耳球虫微线蛋白7基因的克隆、表达及免疫保护性研究
　　本章应用PCR技术扩增第三章鉴定的EmMIC7基因(FR718975)，构建了原核表达质粒pET-32a(+)-MIC7和真核表达质粒pVAX1-MIC7。应用动物保护试验评价rEmMIC7和pVAX1-MIC7对E.maxima感染的免疫保护力，同时也测定了rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖能力。免疫保护试验结果显示相比于对照组，rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫均能够显著减轻空肠病变记分、减少OPG并提高相对增重率(P＜0.05)。rEmMIC7和pVAX1-MIC7组的ACI均大于167。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫一周后提高鸡体血清特异性抗体浓度，在加强免疫一周后特异性抗体浓度达到最大值，并且均显著高于各对照组(P＜0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫均能显著上调鸡体IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β与IL-4浓度(P＜0.05)。MTT试验结果显示rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫鸡脾脏淋巴细胞增殖能力均得到显著提高(P＜0.05）。综上结果表明EmMIC7免疫能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，具有中等的免疫保护性，可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。
　　5.巨型艾美耳球虫顶膜抗原1基因的克隆、表达及免疫保护性研究
　　本章应用PCR技术扩增EmAMA1基因(FN813221.1)，构建了串联EmAMA1基因功能域的重组原核表达质粒pET-32a(+)-EmAMA1FD和真核表达质粒pVAX1-EmAMA1FD。应用动物免疫保护试验评价rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD的免疫保护力同时也检测了rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖效应。免疫保护试验结果显示，rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫组在空肠病变记分、OPG和相对增重等方面均与对照组的差异均显著(P＜0.05)，rEmAMA1FD免疫组的ACI为176.68，pVAX1-EmAMA1FD免疫组的ACI为180.35。血清特异性抗体检测结果表明rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫均能在首次免疫一周后提高鸡血清特异性抗体浓度，在整个采样期间试验组特异性抗体浓度均显著高于各对照组(P＜0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫能够显著提高血清细胞因子引起鸡体产生显著高水平的IL-2、TGF-β与IL-4(P＜0.05)。CCK-8试验结果表明rEmAMA1FD能够显著增强鸡脾脏淋巴细胞增殖效应(P＜0.05）。综上结果表明EmAMA1FD免疫原性较强，能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，对E.maxima感染具有较好的免疫保护性，可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。
　　6.重组MIC蛋白与鸡肠上皮细胞的结合能力
　　本章旨在检测已获得的四种重组E.maxima微线蛋白与不同鸡肠段的结合能力。取无球虫鸡不同的肠段（十二指肠、空肠、盲肠和直肠）制备冰冻切片，应用免疫荧光方法检测前述表达并纯化的四种重组E.maxima微线蛋白——rEmMIC3、rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD与不同鸡肠段的结合能力。试验结果显示rEmMIC3只与鸡空肠结合，与十二指肠、盲肠和直肠均不结合，而rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD与各肠段均不结合。该结果提示仅鸡空肠上皮细胞上存在EmMIC3基因受体，EmMIC3可能是决定E.maxima侵入部位特异性的关键分子，在E.maxima入侵宿主靶细胞的过程中发挥重要功能。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 巨型艾美耳球虫研究进展和鸡球虫病的防控现状

1 E．maxima研究进展

1．1 E．maxima的发现

1．2 E．maxima的发育

1．3 E．maxima卵囊形态

1．4 流行病学

1．5 E．maxima的致病性

1．6 E．maxima的免疫学特征

1．7 同工酶研究

1．8 E．maxima基因序列研究

2 鸡球虫的防控现状

2．1 抗球虫产品的应用

2．2 疫苗

2．3 其他鸡球虫病防控策略

参考文献

第二章 鸡艾美耳球虫微线蛋白研究进展

1 鸡艾美耳球虫微线体蛋白概述

2 各种鸡艾美耳球虫微线体蛋白的研究进展

2．1 鸡艾美耳球虫微线蛋白1

2．2 鸡艾美耳球虫微线蛋白2

2．3 鸡艾美耳球虫微线蛋白3

2．4 鸡艾美耳球虫微线蛋白4

2．5 鸡艾美耳球虫微线蛋白5

2．6 鸡艾美耳球虫顶膜抗原1

参考文献

第三章 巨型艾美耳球虫子孢子空肠上皮细胞结合蛋白的鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 巨型艾美耳球虫子孢子和鸡空肠上皮细胞的分离与纯化

2．2 巨型艾美耳球虫子孢子可溶性全蛋白及其抗血清的制备

2．3 Western blot方法分析巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白与鸡空肠上皮细胞的结合

2．4 LC-MS／MS分析和鉴定结合鸡空肠上皮细胞的E．maxima子孢子可溶性蛋白

2．5 生物信息学分析

3 讨论

参考文献

第四章 巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因的克隆、表达及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 EmMIC3基因的5’和3’端扩增及序列生物信息学分析

2．2 重组表达质粒pET-32a(+)-MIC3的构建和鉴定

2．3 重组MIC3蛋白的诱导表达和纯化

2．4 大鼠抗MIC3多克隆抗体的效价及特异性检测

2．5 EmMIC3免疫保护试验结果

2．6 被动免疫试验结果

2．7 EmMIC3免疫诱导血清抗体水平检测

2．8 EmMIC3免疫诱导血清细胞因子水平检测

2．9 EmMIC3免疫诱导鸡脾脏淋巴细胞增殖水平检测

3 讨论

参考文献

第五章 巨型艾美耳球虫微线蛋白2基因的克隆、表达及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 EmMIC2基因PCR扩增结果

2．2 重组质粒pMD19-T-MIC2的构建和鉴定

2．3 重组质粒pET-32a(+)-MIC2的构建和鉴定

2．4 重组MIC2蛋白的表达和纯化

2．5 Western Blot分析

2．6 真核表达质粒pVAX1-MIC2的构建和鉴定

2．7 真核表达质粒pVAX1-MIC2在鸡体内表达的检测

2．8 EmMIC2免疫保护试验结果

2．9 EmMIC2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖水平

3 讨论

参考文献

第六章 巨型艾美耳球虫微线蛋白7基因的克隆、表达及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 EmMIC7基因PCR扩增结果

2．2 重组质粒pMD19-T-MIC7的构建和鉴定

2．3 重组质粒pET-32a(+)-MIC7的构建和鉴定

2．4 重组MIC7蛋白的表达和纯化

2．5 Western Blot分析

2．6 真核表达质粒pVAX1-MIC7的构建和鉴定

2．7 真核表达质粒pVAX1-MIC7在鸡体内表达的检测

2．8 EmMIC7免疫保护试验结果

2．9 EmMIC7免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖水平

3 讨论

参考文献

第七章 巨型艾美耳球虫顶膜抗原1基因的克隆、表达及免疫保护性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 EmAMA1基因的克隆和序列分析

2．2 AMA1功能域的PCR扩增和克隆

2．3 重组质粒pET-32a(+)-AMA1FD的构建

2．4 重组AMA1FD蛋白的表达和纯化

2．5 Western Blot分析

2．6 DNA疫苗pVAX1-AMA1FD的构建和鉴定

2．7 DNA疫苗pVAX1-AMA1FD在鸡体内表达的检测

2．8 AMA1FD的免疫保护试验结果

2．9 AMA1FD免疫诱导血清抗体水平检测

2．10 EmAMA1FD免疫诱导血清细胞因子水平检测

2．11 EmAMA1FD免疫诱导鸡脾脏淋巴细胞增殖水平检测

3 讨论

参考文献

第八章 重组MIC蛋白与鸡肠上皮细胞的结合能力

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 rEmMIC3与不同鸡肠段结合试验结果

2．2 rEmMIC2与不同鸡肠段结合试验结果

2．3 rEmMIC7蛋与不同鸡肠段结合试验结果

2．4 rEmAMA1FD蛋白与不同鸡肠段结合试验结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间论文发表情况