柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白序列分析与真核表达

摘要

[目的]为了获得重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白.[方法]根据Genebank设计柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因特异引物,RT-PCR扩增该基因,经Blast与Genebank公布的该基因比对,而后构建该蛋白的真核表达载体pPICZaA/EtMIC4N,用毕赤酵母表达系统小规模表达该蛋白,利用SDS-PAGE和Western Blot对表达的蛋白鉴定,再以摇瓶的方式进行大规模表达.[结果]RT-PCR扩增获得柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因序列,大小为773 bp,经比较,与目的基因开放阅读框相似度99.5％,其中有4个碱基发生突变,1个gap.PCR证实成功构建真核表达载体,电转后的毕赤酵母用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot发现在上清中有45 kD的条带,说明成功表达该蛋白,且该表达系统可持续获得较高纯度的目的蛋白,以摇瓶的方式进行大规模表达,每升能够纯化到约10 mg的目的蛋白.[结论]毕赤酵母成功表达重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白,为该蛋白免疫原性的研究奠定基础.