鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白-2的真核表达及免疫原性研究

摘要

鸡球虫病是由顶复门寄生虫——艾美耳球虫引起的世界范围内严重危害养禽业发展的寄生虫病，给养禽业带来巨大的经济损失。目前，养禽业采用抗球虫药、强毒活疫苗、减毒活疫苗来防控鸡球虫病。但他们自身存在的一些缺点使得未能有效防控鸡球虫病，因而研发高效的新型疫苗已成为缓解养禽业亏损的当务之急。基因工程重组蛋白疫苗为新型疫苗的研发提供了重要方向，而筛选出鸡球虫生活史中的特异性抗原对抗球虫重组蛋白疫苗的研制的至关重要。柔嫩艾美尔球虫微线蛋白2(EtMIC2)可以作为新型疫苗的候选抗原来阻断子孢子侵入宿主细胞。为了获得充足的抗原，必须实现EtMIC2蛋白的高效大量表达。而在酵母真核表达系统中，巴斯德毕赤酵母表达系统不仅具有基因操作简单、发酵生长速度快、外源蛋白表达量高、发酵成本低廉等优点，还具有高等真核表达系统的蛋白翻译后的各种修饰作用，如蛋白磷酸化和糖基化修饰功能等。该系统所表达产物的免疫学活性和生物学功能与天然蛋白质较为接近。
　　因此，在本研究中，我们从SD-01株柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子总RNA中扩增并克隆了EtMIC2基因，进一步构建真核表达载体pPIC9-EtMIC2和原核表达载体PET30a-EtMIC2，将阳性重组质粒分别转染毕赤酵母和大肠杆菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统和大肠杆菌分别表达了EtMIC2蛋白。将巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌中表达的EtMIC2蛋白作为基因工程亚单位疫苗分别免疫雏鸡（100μg/只），三次免疫1周后对Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组所有雏鸡进行口服6000E.tenella孢子化卵囊攻虫实验。
　　通过体重增长、相对体重增长率、盲肠损伤计分、卵囊排出量、卵囊减少率、血清抗体水平、细胞因子水平和淋巴细胞转化水平来对它们的免疫保护力进行比较和评价。在体重增长方面:不免疫、攻虫对照组（Ⅱ组）体重增长量明显低于不免疫、不攻虫对照组（Ⅰ组），体重增长率是Ⅰ组的66.39％，表明柔嫩艾美耳球虫能很大程度阻碍雏鸡的生长。两组免疫组的雏鸡体重增长量与Ⅱ组相比均获得了较大提高，而且免疫真核蛋白组雏鸡的体重增长量更高，Ⅲ组和Ⅳ组的体重增长率分别为88.92％、93.66％。在盲肠病变积分(LS)方面:不免疫不攻虫对照组（Ⅰ组）盲肠病变积分为0，不免疫攻虫组(Ⅱ组)盲肠病变积分为3.40±0.17，免疫原核EtMIC2蛋白组（Ⅲ组）肠病变积分为1.76±0.06，免疫真核EtMIC2蛋白组（Ⅳ组）肠病变积分为1.22±0.08，Ⅲ组和Ⅳ组的LS与Ⅱ对照组相比明显降低，而且Ⅳ组与Ⅲ组相比LS降低的更加显著。在卵囊排出量方面:所有免疫组实验动物的卵囊排出量与感染对照组相比都大幅度减少，Ⅳ组平均卵囊减少率达到85.01％，Ⅲ组也达到74.66％。在特异性抗体水平方面:在7日龄和14日龄所有组的抗体水平无明显差异;在21日龄，Ⅲ组和Ⅳ组的抗体水平开始升高，而且到28日龄和35日龄逐渐升高;毕赤酵母表达的EtMIC2蛋白能够刺激鸡体产生更高的抗体水平。在细胞因子水平方面:与不感染球虫对照组（Ⅰ组）相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的IFN-γ因子表达水平明显降低，4个实验组的IL-6因子的表达水平都差异明显，从表达水平由高到低排序依次为Ⅳ组，Ⅲ组，Ⅱ组，Ⅰ组，所有感染球虫组的的IL-17因子表达水平都明显高于Ⅰ组，而且Ⅱ组的IL-17因子表达水平最高。在脾淋巴细胞增殖方面:没添加ConA刺激的所有感染球虫组之间的脾细胞增殖值差异不显著(P＞0.05)，但所有感染球虫组与Ⅰ组比较，脾细胞增殖显著提高(P＜0.05)，经ConA刺激后，脾细胞增殖水平都有所提高;Ⅱ组和Ⅲ组差异不明显;用毕赤酵母表达的EtMIC2蛋白免疫的实验组（Ⅳ组）的脾细胞增殖显著高于其它各组。另外，淋巴细胞亚组分析的结果表明，所有球虫感染组的CD4+和CD8+淋巴细胞数与Ⅰ组相比均显著增加(P＜0.01)，而且Ⅳ组的CD4+和CD8+淋巴细胞数为显著高于其他各组。Ⅱ组和Ⅲ组之间的CD4+和CD8+脾纽胞数无明显差异。
　　综上，与对照组相比，毕赤酵母和大肠杆菌表达的EtMIC2蛋白质都表现出良好的免疫原性，能够刺激宿主产生特异性免疫反应，而且毕赤酵母表达额EtMIC2蛋白比大肠杆菌表达的EtMIC2蛋白能提供更显著地体重增加，更高的特异性抗体水平，减少卵囊排出量和降低盲肠病变。尤其是，毕赤酵母表达的EtMIC2蛋白能诱导更强的细胞免疫反应。