禽致病性大肠杆菌O2:K1菌株IMT5155基因组特征及DE205B株黏附素和转录因子的功能研究

摘要

禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)是一类典型的肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)，APEC通过呼吸道感染禽类，在呼吸道和肺组织定殖，强毒株能引起肺组织的严重病变和炎症反应，包括气囊炎和肺炎，强毒株可以突破肺脏的免疫防御进入血液，进而引起败血症和多系统混合感染。禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是危害养禽业的细菌性传染病之一，对养禽业造成严重损失，由于当前研究成果不能全面揭示APEC感染禽宿主的致病机制，并且APEC具有血清型多样性特征，目前没有有效防控APEC感染禽宿主的疫苗。本文对APEC O2∶K1血清型菌株进行全基因组测序，通过比较基因组分析鉴定APEC基因组特征，对APEC流行毒株进行致病力评价，筛选和鉴定APEC新的毒力因子和转录调节因子，研究结果丰富了对禽致病性大肠杆菌致病机制的认识。
　　1.APEC O2∶K1血清型菌株IMT5155全基因测序及比较基因组学研究
　　本研究首次对APEC O2∶K1血清型毒株IMT5155进行全基因测序，进行比较基因组学研究，分析IMT5155演化关系和基因蓝图，结果表明IMT5155与典型的ExPEC强毒株具有相近的演化关系;通过对IMT5155基因组的毒力岛分析，发现了一个APECO2∶K1血清型菌株特有的基因岛，这个新的基因岛命名为PAI I5155(GI-12);另外，两个六型分泌系统(T6SSs)分别位于IMT5155的基因岛GI-7和GI-16，并且普遍同时存在于ExPEC O1、O2和O18优势血清型菌株;IMT5155含有两个质粒，其中大质粒p1ColV5155含有多类毒力因子，其影响APEC的致病力;对B2 ExPEC泛基因组中毒力因子进行分类和基因分布分析，结果表明B2群ExPEC强毒株基因组中部分类型的毒力因子为APEC/ExPEC特有的毒力因子，比如黏附素、侵袭素、毒素和涉铁系统等;通过4种动物模型对APEC O1∶K1和O2∶K1血清型菌株（中国分离株）进行致病力测定，结果表明这些菌株属于强毒株，能引起较强的禽大肠杆菌病，并且能引起大鼠乳鼠的脑膜炎，表明APEC O1∶K1和O2∶K1菌株可能具有人畜共患潜力。
　　2.APEC自分泌黏附素AatB的鉴定和功能分析
　　通过比较分析APEC基因组发现了一个新的APEC自分泌黏附素基因aatB，其碱基序列长度为1017bp，编码一个36.3kDa的蛋白，对AatB结构预测分析证实其具有典型的AT结构域，包含N端信号肽、膜外功能域和C端β折叠跨膜域，基因分布检测表明aatB在APEC分离株分布率为26.4％(72/273)，而aatB基因在ECOR D和B2群APEC菌株中分布率较高（接近70％）。本研究构建DE205B aatB的缺失株和互补株，实验证实aatB的缺失会降低DE205B对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭的致病力(LD50)，并且降低DE205B在雏鸭肺脏内的定殖能力，而aatB互补株的致病力基本恢复至野生株水平，以上实验结果证实AatB与APEC的致病力有直接相关性，AatB能够影响APEC对宿主细胞的黏附定殖，并且Western blot证实AatB可以激发雏鸭产生对应的抗体。另外，生物被膜实验证实AatB能够介导无FI菌毛E.coli AAEC189生物被膜的形成能力。
　　3.APEC自分泌黏附素UapB的鉴定和功能分析
　　APEC强毒株DE205B编码一个典型的传统AT蛋白UpaB，本研究对该蛋白进行功能鉴定，并构建APEC强毒株DE205B的upaB基因缺失株，结合前期对APEC ATs(AatA和AatB)致病力的研究，构建了基因upaB、aatA和aatB的双缺失和三缺失菌株。PCR检测发现upaB基因在APEC菌株中的分布率为41.9％，并且主要分布于ECOR B2和D群（分布率～70％）;黏附试验证实UpaB介导DE205B对DF-1 cells的黏附，并且UpaB能提高无菌毛菌株AAEC189的凝集和形成生物被膜的能力;与野生株DE205B相比，upaB、aatA和aatB双缺失或三缺失菌株显著降低其对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭早期感染时在肺脏内定殖的能力，伴随着半数致死剂量(LD50)的上升;在DE205B△upaB/△aatA/△aatB早期感染阶段，RT-PCR检测发现该菌株的菌毛黏附素基因(yqiL和yadN)及空泡形成毒素基因vat（编码AT家族蛋白）的转录水平明显高于在体外LB培养时，因此推测在感染过程三缺失菌株DE205B△upaB/△aatA/△aatB试图通过上调毒力因子(YqiL、YadN和Vat)的表达水平以补偿其致病力;实验证实UapB、AatA和AatB均具有免疫原性，疫苗接种相关蛋白对雏鸭具有一定程度上的免疫保护力，因而ATs(UapB、AatA和AatB)可以作为APEC亚单位疫苗的候选对象。
　　4.转录调节因子AutA/AutR调控禽致病性大肠杆菌感染的分子机制
　　禽致病性大肠杆菌(APEC)通过呼吸系统感染禽类宿主，APEC可以迅速地调整毒力相关因子的表达模式以促进对宿主的感染定殖，在这个感染过程中需要特定的转录调节因子参与APEC毒力因子表达调控。这些受调节的毒力因子包含自分泌黏附素和K1荚膜，这两种毒力因子促进APEC黏附定殖于宿主的巨噬/非巨噬细胞，及利于APEC耐受血清杀菌作用。本研究发现并命名了两个新发现的转录调节因子AutA和AutR，基因aurA和autR位于DE205B基因组的UpaB基因簇，基因分布检测证实UpaB基因簇主要APEC B2和D群分离株。RT-PCR和β半乳糖苷酶试验证实AutA和AutR共同调控DE205B黏附素UpaB的表达，电泳迁移分析和体外转录试验证实AutA和AutR可以直接与upaB启动子区域结合，AutA可以激活upaB转录，而AutR通过阻碍AutA的活性来抑制upaB转录。不仅如此，转录组分析发现AutA和AutR共同调节APEC一百多个基因的mRNA转录，受调控的基因表达产物包括黏附素、K1荚膜和酸耐受系统等。进一步研究表明，在APEC与宿主相互作用的时，AutA和AutR共同调节K1荚膜和酸耐受系统的表型异质性表达。本研究证实在APEC与宿主细胞环境互作时，转录调节因子AurA和AutR能互惠型调控黏附素、K1荚膜和酸耐受系统的表达，AutA和AutR能介导DE205B的表型适应力，包括黏附能力、胞内存活能力、血清抗性、雏鸭肺脏内早期定殖和败血症等，AutR和AutR的表型异质性调节能促进APEC的感染。

目录

声明

摘要

符号及缩略语说明

第一章 肠道外致病性大肠杆菌研究进展

1 致病性大肠杆菌流行菌株谱系

2 禽致病性大肠杆菌(APEC)致病机制研究进展

2．1 APEC病原

2．2 禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)

2．3 APEC／ExPEC毒力因子研究进展

3 APEC致病机制

4 研究意义

参考文献

第二章 禽致病性大肠杆菌O2∶K1菌株IMT5155全基因测序及比较基因组学研究

1 材料和方法

1．1 菌株和DNA提取

1．2 主要培养基、试剂及仪器

1．3 IMT5155基因组测序和组装

1．4 IMT5155基因组注释

1．5 IMT5155与其他致病型E．coli的系统演化分析

1．6 IMT5155基因岛(毒力岛)和毒力基因预测

1．8 B2群ExPEC泛基因组的毒力基因在不同类型E．coli中分布情况分析

1．9 APEC分离株致病力测定

2 结果和讨论

2．1 APEC菌株IMT5155测序和基本概况

2．2 IMT5155与其他致病型E．coli的系统演化分析

2．3 IMT5155基因岛(毒力岛)和毒力基因预测

2．4 IMT5155与其他致病型E．coli的比较基因组分析

2．5 IMT5155 ColV质粒p1ColV5155序列分析和鉴定

2．6 B2群ExPEC泛基因组的毒力基因在不同类型E．coli中分布情况分析

2．7 APEC O1、O2和O78菌株的致病力评价

3 结论

参考文献

第三章 禽致病性大肠杆菌自分泌黏附素AatB的鉴定和功能分析

1 材料和方法

1．1 菌株、质粒及实验动物

1．2 主要培养基、试剂及仪器

1．3 引物的设计

1．4 DNA和蛋白序列分析

1．5 aatB基因分布检测

1．6 AatB蛋白表达和抗体制备

1．7 免疫印迹试验(Western Blot)

1．8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)

1．9 基因缺失株的构建

1．10 基因互补株的构建

1．11 生物被膜测定试验

1．12 DF-1细胞黏附和黏附抑制试验

1．14 动物感染试验

2．1 自分泌黏附素AatB结构鉴定

2．2 APEC菌株中aatB基因分布情况

2．3 AatB融合蛋白的表达纯化和三聚体鉴定

2．4 aatB缺失株和互补株的构建和鉴定

2．5 AatB在DE205B和其他菌株中表达鉴定和免疫原性分析’

2．6 生物被膜形成能力测定

2．8 半数致死量(LD50)的测定

2．9 体内定殖试验

3 讨论

参考文献

第四章 禽致病性大肠杆菌自分泌黏附素UapB的鉴定和功能分析

1 材料和方法

1．1 菌株、质粒及实验动物

1．2 主要培养基、试剂及仪器

1．3 引物的设计

1．4 DNA和蛋白序列分析

1．5 upaB基因分布检测

1．6 UpaB蛋白表达、抗体制备和免疫印迹试验

1．7 基因缺失株的构建

1．8 基因互补株的构建

1．9 细菌外膜蛋白、内膜蛋白、胞质蛋白和分泌蛋白组分的分离提取方法

1．10 Western Blot

1．11 荧光标记法检测和定位UpaB蛋白

1．12 生物被膜测定试验

1．13 细菌自凝集试验

1．16 UpaB、AatA和AatB免疫接种试验

1．17 qRT-PCR检测

2 结果

2．1 自分泌黏附素UpaB结构鉴定

2．2 APEC菌株中upaB基因分布情况

2．3 UpaB提高E．coli AAEC189(MG1655Δfim)的自凝集和生物被膜形成能力

2．3 检测DE205B、缺失株和互补株中UpaB的表达

2．4 UpaB定位于菌株DE205B的外膜

2．5 upaB mRNA的转录水平

2．6 缺失upaB基因对DE205B黏附DF-1细胞的影响

2．7 缺失upaB基因对DE205B半数致死量(LD50)能J影响

2．9 双或三缺失upaB、aatA和aatB基因对DE205B黏附DF-1细胞的影响

2．10 双或三缺失upaB、aatA和aatB基因对DE205B半数致死量(LD50)和体内定殖能力的影响

2．12 比较DE205B和DE205BΔupaB／aatA／aatB在体内感染时毒力基因转录谱的差异

2．13 UpaB、AatA和AatB免疫接种试验

3 讨论

参考文献

第五章 转录调节因子AutA／AutR调控禽致病性大肠杆菌感染的分子机制

1 材料和方法

1．1 菌株、质粒及实验动物

1．2 主要培养基、试剂及仪器

1．3 引物的设计

1．4 DNA和蛋白序列分析

1．5 UpaB基因簇分布检测

1．6 AutA∶MBP和AutR∶MBP融合蛋白表达

1．7 基因缺失株和互补株的构建

1．9 RNA-seq转录组测序

1．10 qRT-PCR检测

1．11 共转录测试

1．12 电泳迁移试验

1．13 体外转录试验

1．14 β半乳糖苷酶测定试验

1．15 ELISA检测细菌表面荚膜抗原

1．16 荚膜染色

1．17 耐酸实验

1．18 血清杀菌试验

2．1 两个假定转录调节因子的结构鉴定

2．2 UpaB基因簇在APEC菌株中分布情况

2．3 转录调节因子AutA和AutR共同调控DE205B黏附素UpaB的表达

2．4 AutA和AutR结合PupaB启动子DNA和调控upaB mRNA转录

2．5 全基因组范围内比较缺失株DE205BΔautA、DE205BΔautR和野生株DE205B之间的转录差异

2．6 AutA和AutR共同调控K1荚膜合成和AFI酸耐受相关基因的表达

2．7 AutA和AutR对APEC菌株DE205B酸耐受能力和表面K1荚膜的影响

2．8 DE205B感染过程中K1荚膜、耐酸系统和调节因子AutA／AutR的表型异质性表达

2．9 AutA和AutR影响DE205B致病力

2．10 AutA和AutR介导DE205BΔkps1的黏附能力

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

博士期间发表的论文

致谢