雄激素通过间接调控PLZF介导的精原干细胞分化机制研究

摘要

雄激素是一种在精子发生过程中具有至关重要作用的类固醇激素，但是它在睾丸微环境中发挥作用的分子机制尚未完全揭示。此外，雄激素受体(androgen receptor，AR)是否在生殖细胞表达曾经也是一个有争议的话题。目前许多观点认为，睾丸生殖细胞里不表达雄激素受体，更确切的说，它在小鼠等啮齿类、哺乳类动物的精子持续不断的发生过程中不是必需的。然而，我们的实验结果检测到AR在出生后两天的小鼠睾丸的前精原细胞有微弱的表达，但是在出生后第三天随着前精原细胞的迁移和定植，微弱的AR信号在生殖细胞中消失，并在支持细胞(Sertoli cells)中开始表达。进一步的实验证明，从出生后5天开始小鼠的精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)中缺乏AR的表达，因此我们推测雄激素通过支持细胞中的雄激素受体间接调控精子发生，并以精原干细胞-支持细胞共培养系统和药物阻断雄激素的小鼠为模型来研究AR在精子发生中的调控机制。我们首先建立精原干细胞-支持细胞共培养系统，然后通过添加雄激素和雄激素拮抗剂来调节系统中雄激素的水平，并利用蛋白质免疫印迹技术检测相关信号蛋白的表达，然后对成年小鼠腹腔注射雄激素受体拮抗剂，再应用免疫组化、免疫荧光以及蛋白质免疫印迹技术检测对精子发生的影响，结果显示雄激素对精原细胞中早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemiazinc finger, PLZF)有负调控效应，随后我们利用小于扰RNA(siRNA)技术敲低精原干细胞和支持细胞共培养系统中Wt-1和β1-integrin的表达，发现转录因子Wt-1和跨膜蛋白β1-integrin作为潜在的中间信号分子参与睾丸微环境中支持细胞和精原干细胞的相互作用，调控精子发生。这些结果表明，雄激素以一种间接的方式通过多个步骤的信号转导启动精原干细胞的分化、促进精子发生。本实验通过探讨雄激素对精原干细胞维持基因Plzf的调控作用，进一步揭示了雄激素在精子发生过程中的生物学机制，明确了雄激素对精原干细胞增殖和分化活性的确切影响，从而为治疗雄性动物不育以及人类的生殖疾病提供研究依据。

目录

声明

摘要

本文部分缩略词及中英文对照表

第一章 文献综述

1．1 精原干细胞

1．2 精子发生

1．3 睾酮的产生和生物有效性

1．4 AR在睾丸组织中的表达特征

1．5 AR相关的信号通路

1．5．1 经典的睾酮信号通路

1．5．2 非经典的睾酮信号通路

1．6 精原干细胞的重要标志物——PLZF

1．7 SSC微环境中重要的连接蛋白

1．8 本试验的研究目的和意义

第二章 试验研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 试验结果

2．3．2 PLZF阳性细胞在发育过程中的表达变化规律

2．2．3 AR在小鼠睾丸发育过程中的表达特征

2．3．4 精原干细胞-体细胞体外共培养系统的构建

2．3．5 雄激素和拮抗剂对共培养体系中基因表达的影响

2．3．6 β1-integrin作为一个潜在的信号分子能够调控PLZF表达

2．3．7 拮抗剂腹腔注射小鼠导致睾丸发育滞后

2．3．8 拮抗剂受体小鼠曲精小管内精于发生受阻

2．3．9 阻断雄激素形成的两层精原细胞为正在分化的精原细胞

2．3．10 阻断雄激素后对小鼠睾丸内基因表达的影响

2．4 讨论

参考文献

全文结论

创新点

致谢

攻读硕士期间发表的论文