Bmp4/Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用及其机制研究

摘要

目的:
　　 及意义精原干细胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是位于睾丸曲细精管基膜上既能自我更新维持自身群体恒定，又能定向分化，最终产生精子的一类成体干细胞。近年来，由于SSCs在精子发生机理研究、男性不育治疗、遗传性疾病治疗、转基因动物建立及多潜能干细胞制备等方面的重要价值，探讨SSCs增殖分化的分子调控机制，成为生殖生物学和干细胞生物学研究的热点。
　　 骨形态发生蛋白4（bonemorphogeneticprotein-4，Bmp4）是转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)家族中重要的一员，在胚胎发育时期，对多种细胞的增殖分化具有调控作用。Bmp4基因敲除会引起胚胎中胚层发育缺陷而导致小鼠胚胎性死亡。Bmp4信号转导通路通常由细胞内信号转导蛋白Smad介导。Bmp4通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体(TβRⅡ)结合，再与TβR-Ⅰ受体结合形成复合物。复合物形成激活了Ⅰ型受体的蛋白激酶，从而导致细胞内受体Smads蛋白（如Smad1，Smad5，Smad8）的磷酸化，激活的R-Smads与共用型(CO-Smad4)结合形成Smad蛋白复合物，该复合物进入细胞核内与特异的转录启动子或阻遏蛋白再次结合形成复合物，最终与DNA结合，进行特异的转录调控。研究表明，Bmp4/Smad信号通路参与胚胎干细胞、神经干细胞等干细胞的增殖分化调控。但目前尚未有人研究Bmp4/Smad信号通路在精原干细胞分化过程的作用及其作用机制。
　　 本研究利用体外培养的小鼠精原干细胞，通过免疫荧光染色、实时定量PCR及RNA干扰等方法，检测了外源性Bmp4对SSCs分化的影响，以及在此过程中SSCs分化关键基因sohlh2和c-kit表达变化，从而探讨了Bmp4/Smad信号通路在精原干细胞分化中的作用及其可能的作用机制，为将来男性不育症治疗提供了新的理论和实验依据。
　　 研究方法:
　　 1.SSCs培养鉴定取原代培养的SSCs在MEF饲养层上培养48小时后，通过免疫荧光染色，检测SSCs鉴定标志物PLZF，Oct4在SSCs中的表达。
　　 2.SSCs体外处理将细胞分为三组，分别为:正常对照组（Con组），添加50ng/mLBmp4组（Bmp4组），添加50ng/mLBmp4和2μmol/LBmp4抑制剂组(Bmp4+Bmp4抑制剂组)。培养48小时后，通过免疫荧光，检测Sohlh2、C-kit、Smad和PLZF在三组细胞中的表达及其变化规律。培养24小时后，通过实时定量PCR，检测sohlh2、c-kit、oct4和PLZF基因在三组细胞中mRNA的水平及其变化规律。
　　 3.SSCsRNA干扰将细胞分为四组，分别为:非特异性siRNA+con组，非特异性siRNA+Bmp4组，sohlh2siRNA+con组及sohlh2siRNA+Bmp4组。细胞转染后培养24小时，通过实时定量PCR，检测sohlh2、c-kit、PLZF和oct4基因在四组细胞中的mRNA水平及其变化规律。
　　 结果:
　　 1.形态学观察结果显示，倒置显微镜下可见由十几个细胞聚集成的克隆团，细胞为圆形，细胞大小比较均匀，核大胞体小，核/质比高。免疫荧光染色检测结果显示，PLZF和Oct4在SSCs中特异表达。
　　 2.免疫荧光染色结果显示，Sohlh2、C-kit及Smad的阳性表达主要分布于SSCs克隆团块的周边，PLZF的阳性表达主要分布于SSCs克隆团块的中心。Bmp4组Sohlh2和C-kit的阳性细胞数和表达量均明显高于Con组和Bmp4+Bmp4抑制剂组，Con组和Bmp4+Bmp4抑制剂组之间无显著性差异;Bmp4组Smad的核内表达明显高于其他两组;Con组和Bmp4+Bmp4抑制剂组PLZF的表达明显高于Bmp4组。实时定量PCR结果显示，与Con组相比较，Bmp4组PLZF和oct4mRNA水平明显降低，而sohlh2及c-kitmRNA水平明显增加，差异有显著意义(P＜0.05);Bmp4+Bmp4抑制剂组中各基因表达与Con组无显著差异。
　　 3.细胞转染sohlh2siRNA后，实时定量PCR结果显示，与非特异性siRNA+Bmp4组相比较，sohlh2siRNA+Bmp4组c-kitmRNA水平明显减少，PLZF和oct4mRNA水平明显增加，差异有显著差异(P＜0.05)。与非特异性siRNA+con组相比较，非特异性siRNA+Bmp4组sohlh2和c-kitmRNA水平明显增加，PLZF和oct4mRNA水平明显减少，差异有显著意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.Bmp4可促进小鼠SSCs的分化;
　　 2.Bmp4可通过激活Smad信号通路，上调靶基因sohlh2的表达，从而促进
　　 c-kit的表达，发挥其促进小鼠SSCs分化的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一 实验材料

二 实验方法

实验结果

1．培养鉴定结果

2．SSC分组培养48小时免疫荧光染色结果

3．分组培养48小时实时定量PCR结果

4．细胞转染sohlh2 siRNA，24小时后，实时定量PCR结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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