巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及定向进化

摘要

L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase，EC3.5.1.1)能专一催化水解L-天冬酰胺脱氨基生成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶不仅广泛应用于急性淋巴细胞白血病(ALL)、恶性淋巴瘤(ML)、霍奇金淋巴瘤(HL)等疾病的治疗，而且用于控制高温油炸、烘焙食品中丙烯酰胺的形成而不影响产品的外观、味道。目前L-天冬酰胺酶普遍存在稳定性差、酶活低、pH适用范围窄等问题，限制了其在食品加工中的应用。因此，寻找和发现新型的L-天冬酰胺酶具有深远理论意义和潜在的应用价值。
　　本文针对以上问题，从土壤中筛选分离到一株高效产L-天冬酰胺酶菌株H-1，对其进行了形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定，并对其编码L-天冬酰胺酶基因ansA、ansZ进行了克隆和异源表达，以及对表达产物提纯和重组酶的酶学性质作了初步探讨。同时，对L-天冬酰胺酶的定向进化及其在油炸薯条中的应用进行了研究。主要研究结果分述如下。
　　1.L-天冬酰胺酶产生菌的筛选与鉴定。采用酚红/BTB初筛平板筛选到100余株L-天冬酰胺酶产生菌，并通过摇瓶复筛，从江苏省某天冬酰胺生产企业排放污水口土壤中筛选一株具有较高酶活的菌株H-1，酶活达0.086+0.0023 IU/mL。对菌株H-1进行菌落形态观察、生理生化鉴定及分子生物学鉴定，确定菌株H-1为巨大茅孢杆菌(Bacillusmegaterium)。
　　2.B.megaterium L-天冬酰胺酶的克隆与表达。根据Genbank中B.megateriumWSH-002的全基因组序列成功克隆出B.megaterium H-1 L-天冬酰胺酶基因ansA(1050bp)、ansZ(1113 bp)序列，分别编码349与370个氨基酸蛋白。酶基因分别与表达载体pET-30a，pET-32a连接，成功构建了四个重组表达载体，实现L-天冬酰胺酶基因ansA、ansZ在Escherichia coli中异源表达，其中催化活力最高的pET-30a-BM-ansZ重组菌，经表达条件优化后酶活达4.26±0.22 IU/mL，较野生菌的酶活提高约50倍，将该重组酶命名为BmAase。
　　3.BmAase的分离纯化及其酶学性质研究。表达产物通过Ni亲和柱进行一步纯化，BmAase比活达到146.48U/mg（谷氨酰胺活性可忽略不计）;SDS-PAGE分析与MALDI-TOF-MS检测出其分子量为39.628 kDa。BmAase的最适催化反应条件为40。℃，pH7.0, BmAase具有一个相对较宽的pH活性范围pH5.0-8.0，热稳定性好，60℃/70℃处理12 h仍分别保留70％/55％以上相对活力;BmAase动力学参数米氏常数Km为0.8 mM，最大反应速度Vmax为1.58 IU/μg。
　　4.B.megaterium L-天冬酰胺酶的定向进化。摸索易错PCR反应体系，按Mg2+、Mn2+浓度分别为2mM、0.06mM进行易错PCR反应。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型，经过2轮易错PCR，从8000多个突变株中筛选出酶活最高的突变株2MH6，其比活力为188.69 IU/mg，较BmAase提高约30％。以易错PCR筛选得到的突变体作为亲本进行DNA Shuffling，从5000多个突变株中筛选到突变株S-CA3，其比活力达到249.01 IU/mg，较BmAase提高70％，且该酶在pH5.0-9.0保持活力稳定，拓宽了碱性pH反应范围。
　　5.L-天冬酰胺酶在油炸薯条中的应用。油炸前用L-天冬酰胺酶处理土豆条，通过HPLC-MS检测油炸薯条中丙烯酰胺含量发现，经L-天冬酰胺酶处理后油炸薯条中丙烯酰胺含量降低至7.6％(0.056±0.0056 mg/kg)，而未处理油炸薯条中丙烯酰胺含量高达0.738±0.0163 mg/kg，说明B.megaterium L-天冬酰胺酶能有效控制薯条加工过程中丙烯酰胺的形成。

目录

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表格索引

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摘要

第一章 文献综述

1．2 丙烯酰胺的检测方法

1．3 丙烯酰胺的控制方法

2．2 L-天冬酰胺酶的结构

2．4 L-天冬酰胺酶的定向进化

2．5 L-天冬酰胺酶的应用

3 研究目的、意义及内容

参考文献

第二章 L-天冬酰胺酶产生菌的筛选与鉴定

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 L-天冬酰胺酶产生菌的筛选

2．2 L-天冬酰胺酶高产菌株的鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 Bacillus megaterium L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．2 B．megaterium H-1 L-天冬酰胺酶基因的高效表达

2．3 BmAase蛋白的纯化与验证

2．4 BmAase酶学性质研究

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 L-天冬酰胺酶的定向进化及其在油炸薯条中的应用

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 易错PCR反应体系优化

2．2 易错PCR突变文库的构建与筛选

2．3 易错PCR高酶活突变体的序列分析

2．4 DNA Shuffling文库的构建及筛选

2．5 突变酶的纯化与验证

2．6 突变酶酶学性质初步研究

2．7 突变体的序列分析

2．8 天冬酰胺酶在油炸薯条中的初步应用

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

硕士期间发表文章

致谢