猪卵母细胞向胚胎转换进程中α--Tubulin与H3S10ph的表达与功能研究

摘要

本研究主要采用间接免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术、蛋白免疫印迹技术以及特异性抑制剂处理等方法，对猪卵母细胞向胚胎转换进程中α-Tubulin及H3S10ph的表达与功能进行研究。首先检测了细胞骨架（微管蛋白和微丝蛋白）在卵母细胞成熟分裂和胚胎首次有丝分裂过程中的动态分布，并采用秋水仙碱处理研究微管蛋白与染色体迁移及其向两极分离的关系。为研究H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂过程中对于染色体凝集的作用，我们首先使用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光技术检测H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂过程中的表达与亚细胞定位，在此基础上，通过使用H3S10ph上游蛋白Aurora B特异性抑制剂处理，分析H3S10ph对猪胚胎首次有丝分裂和染色体凝集的影响，揭示H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂进行中的调控作用。试验结果如下: 试验一、猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换过程中细胞骨架的动态分布 免疫荧光染色发现，猪卵母细胞成熟分裂过程中，α-Tubulin在生发泡破裂(GVBD)之后开始组装，在第一次减数分裂中期(MⅠ)形成典型的纺锤体结构，第一次减数分裂后期至末期(ATI)则分布于两组染色体之间，第二次减数分裂中期(MⅡ)在染色体附近重新组装形成典型的纺锤体;微丝蛋白(F-actin)在GVBD之后富集在细胞外周皮质下区域，并分别于MⅠ期和MⅡ期在纺锤体紧邻的皮质区富集形成微丝帽。在猪胚胎首次有丝分裂过程中，微管在前期均匀地分布在胞质中，在前中期围绕染色体开始组装纺锤体，中期和后期形成典型的纺锤体，在胞质分裂期形成中体结构。微丝蛋白在胚胎首次卵裂各个时期主要分布在皮质区和胞质中，尤其富集在胞质分裂期的分裂沟处。在此基础上，通过colchicine处理MⅠ期卵母细胞后，绝大多数卵母细胞纺锤体解聚，染色体排列紊乱，且第一极体(pbI)排出率显著下降;但colchicine撤除后，微管蛋白可重新组成MⅠ期纺锤体结构，延长培养时间后，pbI排出率恢复。本研究结果表明猪卵母细胞成熟分裂及胚胎首次有丝分裂过程中细胞骨架的动态变化具有阶段性分布特点，其亚细胞定位与染色体迁移及其向两极分离密切相关，colchicine能够破坏猪卵母细胞MⅠ期纺锤体结构、抑制pbI排出，并且其对纺锤体的解聚作用具有可逆性。 试验二、猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph的定位与功能 免疫印迹结果显示，H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂各个时期中均有表达，表达水平在前中期达到最大值，并于中后期和胞质分裂期降低。免疫荧光检测结果表明，H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂过程中呈现动态表达，在前期和胞质分裂期均匀的分布在胞质中;在前中期、中期和后期富集在染色体上。使用抑制剂AZD-11152处理猪胚胎，导致首次有丝分裂失败。以上结果表明，H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂过程中持续动态表达，并与染色体动力学分布具有密切的时空相关性。经特异性抑制剂AZD-1152处理后，导致胚胎首次有丝分裂失败，提示H3S10ph是猪胚胎顺利完成首次有丝分裂的关键调节因子。 试验三、猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph的调控机制 在本研究中，通过使用H3S10ph上游调控蛋白Aurora B特异性抑制剂AZD-11152处理猪胚胎细胞，以研究H3S10ph在猪胚胎首次有丝分裂细胞周期进程的调控机制。结果显示，与正常组比较，抑制剂AZD-1152处理48h后，处于胞质分裂期的猪胚胎比例显著减少，而处于分裂前期的胚胎细胞比例显著增多;将胚胎培养至20h（前中期）时，与对照组相比，AZD-1152处理组染色体未能发生凝集的胚胎比例显著升高，且伴随着H3S10ph水平显著下降。以上结果表明，H3S10ph可能主要通过调节胚胎分裂前期染色体的凝集进而参与猪胚胎首次有丝分裂过程的调控。H3S10ph调节作用主要受到上游Aurora B激酶活性的调控。

目录

声明

论文说明

摘要

符号及缩略语

绪论

第一章细胞骨架以及H3S10ph在卵母细胞向胚胎转化过程中的作用

1 卵母细胞向胚胎转化过程中细胞骨架的分布及功能

1．1 卵母细胞成熟分裂向胚胎有丝分裂转换进程

1．2微管蛋白在卵母细胞向胚胎转换中的分布与功能

1．3微丝蛋白在卵母细胞向胚胎转换进程中的分布及作用

2染色体凝集与H3S10ph

2．1染色体凝集

2．2 H3S10ph对有丝分裂过程中染色体凝集的调节机制

第二章猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换过程中细胞骨架的动态分布

1 材料

1．1主要仪器设备

1．2主要试剂及药品

1．3试剂配制

2试验方法

2．1猪卵母细胞采集与成熟培养

2．2胚胎激活

2．3间接免疫荧光染色

2．4激光共聚焦显微镜观察

2．5数据处理

3结果

3．2α-Tubulin与F-actin在猪胚胎首次有丝分裂进程中的动态表达

3．3 colchicine作用MI期猪卵母细胞对体外成熟以及纺锤体的影响

4讨论

4．1 α-Tubulin在猪卵母细胞成熟分裂及胚胎有丝分裂进程中的动态表达

4．2 colchicine处理MI期猪卵母细胞对pbI排出与纺锤体组装的影响

5 小结

第三章猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph的定位与功能

1 试验材料

1．1主要仪器设备

1．2抗体与试剂

1．3抗体和试剂配制

2 方法

2．1猪卵母细胞培养

2．2胚胎激活

2．4间接免疫荧光染色

2．5激光共聚焦显微镜观察

2．6蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．7免疫印迹蛋白强度分析

2．8数据处理

3结果

3．1猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph蛋白的动态表达

3．2猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph亚细胞定位

3．3猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph与α-tubulin的共定位

3．4 AZD-1152对猪胚胎首次有丝分裂的影响

4讨论

4．1 猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph表达与定位

4．2 AZD-1152对猪胚胎首次有丝分裂的影响

5 小结

第四章猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph的调控机制

1试验材料

1．1主要仪器设备

1．2抗体与试剂

1．3试剂配制

2方法

2．1猪卵母细胞采集与成熟培养

2．2胚胎激活

2．5激光共聚焦显微镜观察

2．6蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．7免疫印迹蛋白强度分析

2．8数据处理

3结果

3．1 AZD-1152对猪胚胎首次有丝分裂周期进程的影响

3．2 AZD-1152对猪胚胎首次有丝分裂过程中染色体凝集的影响

3．3 AZD-1152对猪胚胎首次有丝分裂过程中H3S10ph水平的影响

4讨论

5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况