海带渣提取物对四种微藻油脂积累及组成的影响

摘要

为探究海带渣在微藻培养上的应用，尤其是在微藻产油上的效果，本研究针对海带渣本身的特性，采用酶解法制备海带渣提取物(Kelp waste extracts，KWE)，通过测定分析KWE处理后供试微藻的细胞密度、生物量、可溶性糖、可溶性蛋白、中性脂、油脂产率、脂肪酸组成等生理生化指标的变化情况，以及油脂合成途径上关键基因的表达水平，探讨其对微藻生长及油脂积累的影响，以期为微藻和海带渣的进一步开发与利用提供科学依据。主要研究结果如下: 1.明确了KWE的主要成分。本研究采用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶制备KWE，对其主要成分进行分析发现，KWE含有丰富的有机物质和矿质元素，其中有机物质以可溶性糖、褐藻酸和氨基酸为主，含量分别为23.19g/L、6.09g/L和0.19g/L;可溶性糖中以葡萄糖为主，含量为12.05g/L;氨基酸中以丙氨酸(Ala)含量最高，其次为苯丙氨酸(Phe)，分别为39.35μg/mL和27.03μg/mL;矿质元素中以氮含量最高，其次为磷，分别为5.72g/L和5.53g/L。 2.明确了KWE对四种微藻生长及产油的影响。本研究以北极小球藻(The Arctic Chlorella sp.)、小球藻F-275(Chlorella sorokiniana FACHB-275)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、极大螺旋藻(Spirulina maxima)为供试微藻，通过分析比较其在不同浓度KWE处理下的生理生化响应发现，KWE可有效促进两株供试小球藻的生长，缩短其生长周期。与对照相比，8.0％KWE可分别提高两株供试小球藻的生物量产率1.83倍和31.86倍，油脂含量20.78％和25.91％。三角褐指藻和极大螺旋藻分别在1.0％和4.0％KWE处理下表现出更好的生长趋势，但不能提高其总脂含量。高浓度KWE(6.0-8.0％)可显著提两株小球藻以及三角祸指藻的饱和脂肪酸(Saturated fatty acids，SFA)和单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids，MUFA)的比例，显著降低其多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)的比例。 3.明确了KWE中引起供试微藻产生不同生理响应的关键营养因子。本研究针对KWE本身的特性以葡萄糖、硝酸铵、磷酸氢二钾为供试碳、氮、磷源，通过分析在不同浓度碳、氮、磷源处理下供试微藻生理生化指标的变化情况发现: (1)KWE中丰富的可溶性糖是促进小球藻F-275细胞生长、改善脂肪酸组成的关键因素;可溶性糖、氮、磷的联合作用促进小球藻F-275中性脂的提高;可溶性糖和氮的相互作用贡献其高总脂含量。 (2)KWE中大量的氮、磷源明显不利于三角褐指藻细胞的生长;1.0-2.0％KWE促进三角褐指藻生长以及4.0-8.0％KWE提高其中性脂和总脂含量的关键因子是KWE中丰富的可溶性糖。 (3)KWE中丰富的可溶性糖、磷营养对极大螺旋藻的生长具有明显的促进作用，氮营养对其具有显著的抑制作用;4.0-8.0％KWE明显促进极大螺旋藻中性脂累积的关键因素是KWE中的可溶性糖和磷营养。 4.KWE与乙酸钠联合作用可进一步提高小球藻F-275的生物柴油特性。本研究通过分析比较乙酸钠单独作用以及KWE与乙酸钠联合作用下小球藻F-275生理生化指标的变化情况发现,KWE与乙酸钠联合作用可进一步显著提高小球藻F-275的生物量、单位细胞中性脂含量和油脂产率，与乙酸钠单独作用相比，其最大值分别可被提高102.57％、16.32％和129.03％;与KWE单独作用相比，其分别可被提高35.32％、253.35％和70.74％。8.0％KWE与3.0g/L乙酸钠联合作用可将小球藻F-275C16∶0和C18∶ln9c的比例分别提高至28.71％和37.76％，C18∶2n6c和C18∶3n3的比例分别降低至11.88％和4.90％。 5.明确了KWE处理下小球藻F-275油脂、脂肪酸等指标的积累规律。通过系统地分析在葡萄糖、KWE、乙酸钠以及KWE与乙酸钠联合作用处理下培养14d内小球藻F-275的油脂、脂肪酸等生化成分的变化情况发现: (1)随培养时间的延长，不同处理小球藻F-275中性脂、总脂含量呈明显增加的趋势，油脂产率呈明显降低的趋势，均在KWE与乙酸钠联合作用处理下获得最大值。 (2)随培养时间的延长，KWE与乙酸钠联合作用下C16∶0和C18∶ln9c的比例呈显著增加的趋势，C18∶2n6c和C18∶3n3呈显著降低的趋势，C16∶1和C18∶0的比例变化相对较小;SFA和MUFA的含量呈明显增加，PUFA的含量呈明显降低的趋势。 (3)随培养时间的延长，KWE与乙酸钠联合作用下小球藻F-275胞内可溶性糖、蛋白呈先增加后降低的趋势;该处理可显著提高培养6-14d小球藻F-275的单位细胞可溶性糖含量和单位体积可溶性蛋白含量，在培养14d分别比KWE单独处理高1.70倍和22.43％，比乙酸钠单独作用高3.09倍和45.39％。 6.初步明确了KWE作用下小球藻F-275部分油脂合成关键基因的表达水平。通过分析不同处理下培养2、8、12d（分别代表对数期、稳定初期和稳定期）部分油脂合成关键基因的表达情况发现，KWE及其与乙酸钠联合作用对编码小球藻F-275磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、二酰基甘油酰基转移酶、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶等酶基因的上调作用主要表现在稳定初期和稳定期，对编码乙酰辅酶A羧化酶基因的上调作用主要表现在对数期。 7.明确了KWE处理下小球藻F-275培养液的pH、可溶性糖、总氮的变化规律。研究发现，小球藻F-275在pH值为6.26-10.43的培养环境中均可快速的生长。随培养时间的延长，不同处理培养液中可溶性糖和总氮的含量呈显著降低的趋势;KWE及其与乙酸钠联合作用处理的总氮含量分别在培养第2、3d就降低至零，可显著提高培养液的碳氮比。通过测定分析培养14d内不同处理小球藻F-275的光合特性以及培养2、8、12d溶解氧的变化情况发现，基于KWE的培养可显著提高小球藻F-275的呼吸作用和光合作用。 上述研究结果表明，在KWE作用下可实现小球藻F-275的高生物量、高油脂产率培养，与适量的乙酸钠联合作用效果更显著，脂肪酸组成更加适合生物柴油的生产，同时还可显著提高其单位细胞可溶性糖含量以及单位体积可溶性蛋白含量。KWE及其与乙酸钠联合作用可能主要通过调节培养液的碳氮比，影响其光合、呼吸速率以及部分油脂合成关键基因的表达，从而调控小球藻F-275的碳源分配、促进油脂的合成。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章文献综述

1 微藻在生物柴油上的应用

2环境条件对微藻生长及油脂积累的影响

2．1环境条件对微藻生长的影响

2．2环境条件对微藻油脂积累的影响

3微藻油脂的合成机理

3．1脂肪酸的合成

3．2 TAG的合成

3．3微藻细胞中调控油脂合成的关键酶

3．4微藻细胞中调控脂肪酸合成的关键酶

4环境条件对微藻产油的调控机理

4．1外源提供碳源对微藻油脂积累的调控机理

4．2氦胁迫对微藻油脂积累的调控机理

4．3其他环境因素对微藻油脂的调控机理

5海带渣的产生与应用

5．1海带渣的产生及营养价值

5．2海带渣的应用

6选题依据及研究意义

7研究内容与技术路线

第二章海带渣提取物的制备及成分分析

1材料与方法

1．1供试材料

1．2主要试剂及配制方法

1．3仪器

1．4海带渣提取物的制备

1．5测定指标及方法

1．6数据处理

2结果与分析

2．1海带渣的主要成分分析

2．2海带渣提取物的主要成分分析

2．3海带渣及其海带渣提取物中氨基酸的组成分析

2．4海带渣提取物中可溶性糖的成分分析

3讨论

4本章小结

第三章海带渣提取物对微藻生长及油脂积累的影响

1材料与方法

1．1供试材料

1．2主要试剂及配制方法

1．3仪器

1．4实验设计

1．5测定指标及方法

1．6数据处理

2结果与分析

2．1 海带渣提取物对四种微藻生长的影响

2．2海带渣提取物对四种微藻光合特性的影响

2．3海带渣提取物对四种微藻油脂含量及脂肪酸组成的影响

2．4海带渣提取物对四种微藻胞内可溶性糖含量的影响

2．5海带渣提取物对四种微藻胞内可溶性蛋白含量的影响

2．6海带渣提取物对四种微藻叶绿素含量的影响

3讨论

4本章小结

第四章不同碳、氮、磷水平对微藻生长及油脂积累的影响

1材料与方法

1．1供试材料

1．2主要试剂及配制方法

1．3仪器

1．4实验设计

1．5测定指标及方法

1．6数据处理

2结果与分析

2．1不同碳、氮、磷水平对微藻生长的影响

2．2不同碳、氮、磷水平对微藻胞内可溶性糖含量的影响

2．3不同碳、氮、磷水平对微藻胞内可溶性蛋白含量的影响

2．4不同碳、氮、磷水平对微藻叶绿素含量的影响

2．5不同碳、氮、磷水平对微藻中性脂和总脂含量的影响

2．6不同碳水平对小球藻F-275脂肪酸组成及含量的影响

3讨论

4本章小结

第五章海带渣提取物与乙酸钠联合作用对小球藻F-275生长及油脂积累的影响

1．2主要试剂及配制方法

1．3仪器

1．4实验设计

1．5测定指标及方法

1．6数据处理

2结果与分析

2．1 KWE与乙酸钠联合作用对小球藻F-275生长的影响

2．2 KWE与乙酸钠联合作用对小球藻F-275油脂和脂肪酸的影响

2．3 KWE与乙酸钠联合作用对小球藻F-275生化组成的影响

2．4 KwE与乙酸钠联合作用对小球藻F-275叶绿素含量的影响

3讨论

4本章小结

第六章海带渣提取物作用下小球藻F-275的油脂积累机制探究

1材料与方法

1．1供试材料

1．2主要试剂及配制方法

1．3仪器

1．4实验设计

1．5测定指标及方法

1．6数据处理

2结果与分析

2．2不同处理小球藻F-275叶绿素含量的变化情况分析

2．3不同处理小球藻F-275碳水性化合物的积累情况分析

2．4不同处理小球藻F-275胞内可溶性蛋白的积累情况分析

2．5不同处理培养液中pH值、总氮的变化情况分析

2．6不同处理小球藻F-275中性脂含量的变化情况分析

2．7不同处理小球藻F-275总脂含量的变化情况分析

2．8不同处理小球藻F-275中性脂、糖脂和磷脂含量的变化情况

2．9不同处理小球藻F-275主要脂肪酸含量的变化情况分析

2．10不同处理小球藻F-275主要生化成分的积累情况分析

2．11不同处理小球藻F-275的光合特性分析

2．12不同处理小球藻F-275溶解氧的变化情况分析

2．13不同处理小球藻F-275油脂合成关键基因的表达情况分析

3讨论

4本章小结

第七章结论与展望

1结论

2展望

创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的学术成果