Alpha--低聚半乳糖的酶法合成、生理活性评价及其构--效关系研究

摘要

低聚半乳糖是一类由半乳糖苷键连接的具有2-10个单糖单元的功能性低聚糖，具有调节肠道菌群结构、降低癌症风险、增强心血管功能、提高机体免疫功能、保持尿路健康、调节炎症反应、降血压降血脂、抗菌抗病毒、防止骨质疏松等多种生理功能。商业化通过酶法合成手段生产β-低聚半乳糖已经具有成熟的技术，而对于α-低聚半乳糖酶法合成的研究远远少于β-低聚半乳糖。目前已知的α-低聚半乳糖多存在于天然豆科植物或中草药材中，现有研究大多以从天然材料中提取的α-低聚半乳糖混合物为研究对象，缺少对其构效关系的探究。因此本研究通过酶法合成α-低聚半乳糖，通过分离纯化、结构鉴定得到具有新型结构的α-低聚半乳糖。以这些新合成的α-低聚半乳糖和从天然材料中提取的α-低聚半乳糖为研究对象，分别评价他们的肠道菌群调节作用、体外免疫调节活性、抵抗结肠炎活性和代谢综合征调节作用，为进一步探究α-低聚半乳糖的生理活性及其构效关系提供理论依据。具体研究内容如下: 1.α-低聚半乳糖的酶法合成及其结构鉴定 本研究以90％的过饱和半乳糖溶液为底物，选取来源于黑曲霉(Aspergillus niger DS)的α-半乳糖苷酶为催化剂，在一定条件下进行酶法合成反应，通过高效液相色谱(HPLC)分析以及折射光示差检测(RID)得到U1、U2、U3、U4四类反应产物。使用中压制备色谱结合活性炭-硅藻土填料以及常压制备色谱结合聚丙烯酰胺凝胶层析柱对四类反应产物进行分离纯化。通过ESI-TOF-MS鉴定得到U1和U2为二糖结构;U3和U4为三糖结构。通过核磁共振(NMR)鉴定得到U2结构为α-(1→6)Gal2;U4结构为α-(1→6)Gal3;U1和U3为多种化合物的混合物。进一步用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生方法结合HPLC和二极管阵列检测器(DAD)分析，推测U1为α-(1→1)Gal2、α-(1→2)Gal2、α-(1→3)Gal2、α-(1→4)Gal2的混合物;U3为以一个α-(1→6)糖苷键和一个其他α构型糖苷键连接的低聚半乳三糖混合物。同时，通过反应条件优化分析，发现该酶法合成反应在底物浓度为90％的半乳糖溶液、反应温度为60℃、酶用量大于30UM/g半乳糖、反应pH在3.5-5.5的条件下，α-低聚半乳糖的产率达到最大。 2.不同结构α-低聚半乳糖的体外肠道微生物调节作用研究 以酶法合成得到的α-低聚半乳糖(U1、U2、U3、U4以及它们的混合物α-GOSg)和从天然原料中提取的α-低聚半乳糖（甘露三糖、水苏糖、鹰嘴豆糖醇和毛蕊花糖）为研究对象，通过体外粪样混合厌氧发酵方法结合原位荧光杂交(FISH)和HPLC分析不同结构α-低聚半乳糖对肠道菌群的调节作用以及对短链脂肪酸(SCFAs)分泌的影响。结果表明，所有α-低聚半乳糖处理组均显著促进了肠道总菌群、双歧杆菌（Bifidobacterium spp.）、乳酸杆菌/肠球菌（Lactobacillus/Enterococcus spp.）以及拟杆菌-普雷沃氏菌（Bacteroides-Prevotella spp.）的增殖;除了毛蕊花糖以外，其他结构的α-低聚半乳糖并没有显著增加溶组织梭状菌（Clostridium histolyticum）和球形梭菌（Clostridium coccoides-Eubacterium rectale）的数量。所有α-低聚半乳糖处理组均显著促进了包括乙酸、乳酸、丙酸、丁酸以及总SCFAs的释放。 在厌氧发酵24h时，微生物增殖数量达到最大，比较该时刻不同结构α-低聚半乳糖处理组之间的差异。不同结构α-低聚半乳糖对Bifidobacterium spp.的增殖作用依次为毛蕊花糖＞U4＞U3=水苏糖＞U2=鹰嘴豆糖醇＞U1=甘露三糖。不同结构α-低聚半乳糖对Lactobacillus/Enterococcus spp.的增殖作用依次为毛蕊花糖＞水苏糖＞U4＞鹰嘴豆糖醇=U2＞U3=甘露三糖＞U1。发现在结构相同的情况下，高聚合度的α-低聚半乳糖对Bifidobacterium spp.和Lactobacillus/Enterococcus spp.的增殖作用更明显;相同聚合度的情况下，仅由半乳糖连接的α-低聚半乳糖比含有葡萄糖或果糖结果的α-低聚半乳糖效果更好，并且以α-(1→6)半乳糖苷键连接的α-低聚半乳糖对益生菌的增殖作用好于其他半乳糖苷键型连接的α-低聚半乳糖。同时，从天然产物中提取得到的α-低聚半乳糖对乳酸的促进释放作用更显著，而通过酶法合成得到的α-低聚半乳糖促进乙酸和丁酸分泌的作用更明显。 3.不同结构α-低聚半乳糖的体外免疫调节作用研究 以酶法合成得到的α-低聚半乳糖(U1、U2、U3、U4以及它们的混合物α-GOSg)和从天然原料中提取的α-低聚半乳糖（甘露三糖、水苏糖、鹰嘴豆糖醇和毛蕊花糖）为研究对象，通过体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞评价不同结构α-低聚半乳糖的免疫调节作用。结果表明所有α-低聚半乳糖都显著促进了巨噬细胞吞噬作用，促进了巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-1β及IFN-γ细胞因子，并且在样品浓度为25-200μg/mL范围内呈现剂量依赖的特征。通过比较不同结构构型α-低聚半乳糖的免疫调节作用，一定程度上表明以α-(1→6)半乳糖苷键连接的α-低聚半乳糖相较于其他键型连接的α-低聚半乳糖具有更好的免疫调节作用，在此基础上分子量更大的、聚合度更高的α-低聚半乳糖的免疫调节功能更优。 4.α-低聚半乳糖对结肠炎的抑制作用研究 以酶法合成得到的α-低聚半乳糖混合物(α-GOSg)和从大豆中提取得到的棉子糖家族低聚糖(RFOs)为研究对象，探究其对DSS诱导的急性结肠炎小鼠的抗炎症作用。结果表明以α-GOSg和RFOs饲养结肠炎小鼠缓解了DSS导致的小鼠体重下降，显著减少了粪便中血红素含量，抑制了结肠缩短。通过结肠组织病理学分析，发现α-GOSg和RFOs显著抑制了DSS造成的肠道黏膜溃烂，并且α-GOSg的保护效果显著优于RFOs。通过定量PCR分析手段发现α-GOSg和RFOs显著抑制了DSS引起的COX-2，IL-6和CSF-1这些炎症因子的上调。最后，通过免疫组织染色分析，发现α-GOSg和RFOs抑制了结肠中细胞核因子NF-κB的表达水平，然而只有α-GOSg处理组与模型组有显著性差异。因此，α-GOSg和RFOs能通过抑制结肠炎小鼠NF-κB的表达起到抵抗结肠炎的作用，同时，α-GOSg较RFOs表现出了更好的抗结肠炎效果。 5.α-低聚半乳糖对代谢综合征的调节作用研究 以新型的西式高脂饮食(HFWD)持续喂养小鼠13周诱导代谢综合征小鼠模型，通过给予HFWD诱导的代谢综合征小鼠α-GOSg和RFOs，评价其对代谢综合征的调节作用。结果表明α-GOSg显著抑制了HFWD导致的小鼠体重增加。通过生理生化分析，发现α-GOSg和RFOs显著降低了小鼠体脂含量，显著减少了血液中总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)的含量，但是对小鼠血糖水平、胰岛素水平和胰岛素抵抗并没有产生显著影响。通过肝脏病理组织分析表明α-GOSg和RFOs处理组小鼠肝脏的脂肪变性得到了抑制。说明α-GOSg和RFOs均表现出了对肥胖小鼠代谢紊乱的抑制作用，其中，α-GOSg较RFOs在各项指标上都具有更好的效果，可能表明α-GOSg对抑制代谢综合征的发生具有更好的作用。通过定量PCR分析手段发现α-GOSg处理显著下调了HFWD引起的小鼠肝脏中乙酰辅酶A羧化酶(ACC-α)的表达。同时α-GOSg处理显著降低了小肠内胆汁酸的含量，增加了的小鼠体内Bifidobacterium的数量，抑制了Clostridium leptum的增殖。表明α-GOSg对代谢综合征小鼠的抑制作用可能是通过促进体内益生菌在增殖，进一步促进小肠末端胆汁酸的降解而起的作用。同时，α-GOSg还有可能通过影响脂肪酸的从头合成起到缓解机体肥胖的作用。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一章绪论

1．1功能性低聚糖概述

1．2 GOS的生理活性

1．2．1调节肠道微生物结构

1．2．2缓解便秘

1．2．3促进矿物质吸收

1．2．4预防癌症

1．2．5免疫调节作用

1．2．6预防炎症性肠病

1．2．7调节代谢综合征

1．3．1植物来源的α-GOS

1．3．2动物来源的α-GOS

1．4α-GOS的制备方法

1．4．1从天然产物中提取

1．4．2酶法合成

1．4．3酶法降解

1．4．4化学合成

1．4．5化学降解

1．5 GOS的开发利用

1．6立题意义及研究内容

参考文献

第二章α-低聚半乳糖的酶法合成及结构鉴定

2．1材料、试剂和仪器

2．1．1材料与试剂

2．1．2主要仪器

2．2实验方法

2．2．1α-半乳糖苷酶酶活力的测定

2．2．4酶法合成产物检测方法

2．2．5酶法合成产物分离纯化

2．2．6酶法合成产物结构鉴定

2．2．7酶法合成反应条件优化

2．3结果与分析

2．3．1α-半乳糖苷酶酶活力及稳定性

2．3．2酶法合成反应产物分析

2．3．3未知化合物的结构鉴定

2．3．4酶法合成反应条件的优化

2．4本章小结

参考文献

第三章α-低聚半乳糖的肠道微生态调节作用

3．1材料、试剂和仪器

3．1．1实验材料

3．1．2主要试剂

3．1．3主要仪器

3．1．4主要探针

3．2实验方法

3．2．1培养基与试剂配置

3．2．2体外厌氧粪样混合培养

3．2．3肠道菌群的FISH计数

3．2．4 SCFAs的测定

3．2．5统计分析

3．3结果与分析

3．3．1厌氧发酵体系中肠道菌群的变化

3．3．2厌氧发酵体系中短链脂肪酸的变化

3．4讨论

3．5本章小结

参考文献

第四章α-低聚半乳糖的体外免疫调节活性

4．1材料、试剂和仪器

4．1．1实验材料

4．1．2实验细胞株

4．1．3主要试剂

4．1．4主要仪器

4．2实验方法

4．2．1培养基与试剂配置

4．2．2 RAW264．7细胞培养

4．2．3 RAW264．7细胞增殖实验

4．2．4吞噬中性红实验

4．2．5 NO释放量的测定

4．2．6细胞因子的测定

4．2．7统计分析

4．3结果与分析

4．3．1 RAW264．7细胞增殖实验

4．3．2吞噬中性红实验

4．3．3不同处理组RAW 264．7细胞NO释放量影响

4．3．4不同处理组RAW264．7细胞因子释放量影响

4．4讨论

4．5本章小结

参考文献

第五章α-低聚半乳糖对葡聚糖硫酸钠引起的急性结肠炎的抑制作用

5．1材料、试剂和仪器

5．1．1实验材料

5．1．2实验动物

5．1．3动物饲料

5．1．4主要试剂

5．1．5主要仪器

5．2实验方法

5．2．1动物实验设计

5．2．2粪便血红素含量的测定

5．2．3结肠组织病理学分析

5．2．4肠道RNA提取及实时荧光定量PCR分析

5．2．5结肠组织的免疫组织化学分析

5．2．5统计分析

5．3结果与分析

5．3．1食物和水摄入情况

5．3．2体重变化

5．3．3固态粪便重量变化

5．3．4α-GOSg和RFOs对粪便中血红素含量的影响

5．3．5α-GOSg和RFOs抑制急性结肠炎引起的结肠缩短

5．3．6结肠组织的病理学分析

5．3．7定量PCR分析炎症因子表达水平

5．3．8免疫组织化学分析

5．4讨论

5．5本章小结

参考文献

第六章α-低聚半乳糖对西式高糖高脂饮食诱导的代谢综合征的作用

6．1材料、试剂和仪器

6．1．1实验材料

6．1．2实验动物

6．1．3动物饲料

6．1．4主要试剂

6．1．5主要仪器

6．2实验方法

6．2．1动物实验设计

6．2．2血清中生化指标分析

6．2．3肝脏组织病理学分析

6．2．4组织脂质含量分析

6．2．5胆汁酸含量测定

6．2．6实时荧光定量PCR分析

6．2．7统计分析

6．3结果与分析

6．3．1食物和水摄入情况

6．3．2体重和体脂变化

6．3．3α-GOSg和RFOs对血糖和胰岛素水平的影响

6．3．4血液生化指标分析

6．3．5 α-GOSg和RFOs对抑制脂肪肝的作用

6．3．6粪便脂质含量分析

6．3．7α-GOSg和RFOs对胆汁酸代谢的影响

6．3．8脂代谢基因表达水平

6．3．9粪便菌群微生物分析

6．4讨论

6．5本章小结

参考文献

全文结论与展望

论文创新点

附录

致谢

博士期间论文发表和专利申请情况