猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立及猪鼻支原体单克隆抗体的鉴定

摘要

近年来，随着猪场恶性传染病的逐步控制，以支原体为代表的慢性呼吸道传染病成为疫病控制的焦点。本研究围绕猪肺炎支原体和猪鼻支原体的检测方法及工具开展相关研究。(1)猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道疾病-猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine，MPS)的病原。该病容易引起其他病原继发感染，引发猪呼吸道疾病综合征。目前，我国主要使用灭活疫苗防控MPS。灭活疫苗中抗原含量是决定猪支原体肺炎疫苗质量和免疫效力的关键之一。本试验拟建立一种灭活疫苗体外效力检测方法，以期成为动物试验的替代方法用于MPS灭活疫苗的效力检验。研究中，以P46蛋白为基础建立了双抗体夹心ELISA方法并对其反应条件进行优化，应用该方法对培养抗原和成品疫苗进行了定量检测，并与传统检测方法进行对比，证明该ELISA可作为疫苗生产中Mhp定量的可靠方法使用。(2)猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)普遍存在于猪的鼻腔、气管和支气管分泌物中，可引起多发性浆膜炎、肺炎、关节炎及中耳炎等临床症状，导致猪生长性能下降，并可与多种呼吸道病原混合感染，加重病情。Mhr临床猪场感染率高、适应力强，极难净化，近年来临床关注度日渐增加。同时Mhr与多种人类肿瘤相关，属于人兽共患病原。但目前，Mhr的诊断技术尚不完善，其感染机制研究尚处于起步阶段。本试验对制备的一株猪鼻支原体的单克隆抗体进行了全面鉴定，为Mhr的致病机理及病原诊断研究提供重要试验工具。 本研究主要从以下几个方面开展: 1、Mhp抗原定量ELISA检测方法的建立及其用于抗原培养物检测研究。以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体，抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。优化其反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL，抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释倍数分别为1∶40000和1∶10000。该ELISA的重复性变异系数小于10％,最低检出量为9.754ng/mL，与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测，通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算，得出两种计算方法结果均与真实值基本相符，但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。使用该方法检测的猪肺炎支原体菌液抗原含量与颜色单位改变法(color changing units，CCU)检测结果基本相符。 2、Mhp抗原定量ELISA检测方法用于成品疫苗检测研究。采用低温冻融法、95％乙醇法、三氯甲烷法、正丁醇法及丙酮法几种破乳方法，通过夹心ELISA方法对猪肺炎支原体油包水型灭活疫苗中的抗原含量进行测定，并对测定结果进行比较，从而筛选出适合猪肺炎支原体油包水型灭活疫苗中抗原含量测定的方法，并与兔免疫抗体检测法进行了对比，探索了该方法作为疫苗效力检验替代方法的可行性。实验结果表明，丙酮法用于处理肺炎支原体油包水型灭活疫苗效果较好，与其他方法相比，该方法提取效率高，消耗低，破乳剂对有效抗原干扰较小。利用该方法处理成品疫苗后进行夹心ELISA检测，可准确检测出不同效价成品疫苗中的抗原含量差异。 3、一株猪鼻支原体单克隆抗体的制备与鉴定。将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，鉴定其抗体亚型，测定纯化单抗的效价、特异性，并将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验。获得了1株猪鼻支原体单抗，命名为Mhr-08。该单抗的亚型属于IgG1，轻链为κ型。ELISA测定该纯化单抗效价为1∶102400，Western-blot检测结果表明，该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43kDa处出现特异性反应条带，与其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体，可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体，该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断技术及致病机理的研究提供了工具。 综上所述，本研究建立了一种双抗体夹心ELISA方法可用于Mhp培养物及灭活疫苗的Mhp抗原定量检测，为Mhp灭活疫苗生产及效力检验提供了参考方法;同时，本研究对所制备的一株猪鼻支原体单克隆抗体进行了鉴定，证明其为一种特异性针对Mhr表面膜脂蛋白的单抗，为猪鼻支原体致病机理、病原检测的研究提供了重要工具。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

绪论

第一篇文献综述

第一章猪肺炎支原体研究进展

1．猪肺炎支原体概述

2．猪肺炎支原体致病机理

3．猪肺炎支原体检测

4．猪肺炎支原体疫苗研究进展

5．ELISA方法在灭活疫苗抗原检测中的应用

第二章猪鼻支原体研究进展

1．形态特征

2．培养特征

3．猪鼻支原体的致病机制

4．猪鼻支原体的病原检测技术

第二篇实验部分

第一章猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立及用于培养物检测的研究

1．试验材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二章猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法用于成品灭活疫苗的检测研究

1．试验材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三章一株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

结论与展望

附录

致谢

个人简历与攻读学位期间发表的学术论文