抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用

摘要

本发明提供抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用，涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。所述抗猪SC蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株4H11分泌，保藏号为：CCTCC NO：C201526。本发明还要求保护该单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。本发明试剂盒具有高特异性、高稳定性、高敏感性，检测样品取样方便，可区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感染，可用于肺炎猪支原体感染的早期诊断及弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估。

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域，具体涉及抗猪SC蛋 白单克隆抗体及其在应用。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎 (MPS)，俗称猪气喘病的病原。猪气喘病是猪群中流行最广、传播最快、最难净 化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤 毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功 能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。

研究表明，对MPS的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和黏膜免疫。SIgA (分泌型免疫球蛋白A)是参与黏膜免疫反应的主要效应因子。它们是机体免 疫系统中的重要组成部分，在免疫应答中分别起着重要作用。SIgA能够抗病毒、 中和毒素及其它生物活性抗原，具有广泛的免疫保护作用，但最主要的保护作用 是阻止细菌对上皮细胞表面粘附，并清除入侵的病原。它也是病原体侵入后最先 产生的免疫反应，因此，常根据特异性SIgA的检测作为疾病的早期诊断。SIgA 由分泌成份(SC蛋白)、IgA和J链构成。SC蛋白是上皮细胞上的多免疫球蛋 白受体(PlgR)的胞外段部分，是黏膜免疫的第一防线,能够阻止呼吸道与肠腔中 的病毒、细菌、毒素和外来异物等有害物质的入侵。SC蛋白增强了SIgA的最佳 保护作用,使SIgA对蛋白酶的敏感性下降,黏液更粘稠,增强了黏附作用及防御 能力。SC蛋白是黏膜免疫系统的重要组分,当SC不能正常产生时,会导致slgA无 法正常合成而引发多种疾病。SC蛋白还是区分血清型IgA和分泌型IgA的标志。

抗猪肺炎支原体SIgA是Mhp感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性标 志，同时也反映了疫苗免疫后的保护效果。

猪肺炎支原体的诊断方法包括病原检测和血清抗体检测。病原检测方法包括 病原的分离与鉴定，聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR和原位杂交法，但 是这些方法均存在敏感性和特异性较低、耗时较长、检测难度大、检测结果不确 定性、所需设备条件和不适合活体检测等缺点。血清抗体检测方法包括：微量间 接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但是，IHA的检测中存 在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝集终点判定的主观性较强以及本身 固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的Mhp检测中实际应用前景有限。 现有检测血清抗体的ELISA方法的敏感性和特异性不能满足诊断要求。另外， 目前所用的ELISA方法均是用来检测Mhp IgG抗体。由于猪肺炎支原体感染后， IgG抗体产生相对较慢；且研究表明，全身的体液免疫对该病原的免疫保护作用 不大。相反，呼吸道局部产生的黏膜免疫和细胞免疫能产生较好的免疫保护效果。 因此，现有血清抗体的ELISA不适用于该病的早期诊断与主动免疫后免疫指标 的监测。

R1区是Mhp纤毛黏附蛋白(又称为黏附因子或黏附素)P97的一个重复单 元，存在于纤毛黏附蛋白P97的C端，也是该蛋白主要的抗原决定簇。Mhp纤 毛黏附蛋白P97的R1区称为P97R1蛋白。Mhp通过粘附感染猪支气管纤毛上皮 细胞，继而产生后续的致病作用。机体针对支原体的粘附能迅速产生相应的黏膜 免疫反应。若利用P97R1蛋白作为包被原能在感染后第一时间检测到相应的 SIgA反应，适合于该病的早期诊断。且P97蛋白具有种属特异性，与其它猪支 原体不存在血清学交叉干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的在于提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗 体，该单克隆抗体具有较高的特异性。

本发明的再一目的是提供所述抗猪SC蛋白单克隆抗体在制备猪肺炎支原体 SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。

本发明的又一目的是提供猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，具有 较高的特异性、灵敏度和稳定性，可以区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感 染，用于早期诊断；还可用于猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11，保藏号为：CCTCC  NO：C201526。

本发明还要求保护所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在 制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。

猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，含有通过抗体捕获法制备的包 被有猪肺炎支原体P97R1蛋白的检测板和含有辣根过氧化物酶标记的抗猪SC蛋 白单克隆抗体的酶结合物工作液，所述抗猪SC蛋白单克隆抗体是由权利要求1 所述杂交瘤细胞株分泌。

在本发明中，包被有猪肺炎支原体P97R1蛋白的检测板采用如下方法制备： 将检测板先采用抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体包被，然后采用猪肺炎 支原体P97R1蛋白包被。

优选的技术方案中，所述抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体的包被浓 度为1.5-2.5μg/mL，所述P97R1蛋白的包被浓度1.5-2.5μg/mL。

在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照液，阴性对照液，洗涤液，显色液 和终止液。

优选的技术方案中，阳性对照液为人工感染猪肺炎支原体的猪肺泡灌洗液， 阴性对照液为未感染猪肺炎支原体的猪肺泡灌洗液；洗涤液配制方法：取40g  NaCl、1.0g KCl、14.5g Na₂HPO₄·12H₂O、1.2g KH₂PO₄、2.5ml吐温-20溶于去离 子水，定容至500ml；显色液包括显色液A和显色液B，其中显色液A是将21mg 3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于5ml无水乙醇后得到；所述显色液B是将33mg过氧 化脲素溶于200ml磷酸盐缓冲液后得到；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

有益效果：

1.高特异性：本试剂盒通过以下三个方面确保检测的高特异性。(1)通过 单抗捕获包被法确保包被抗原P97R1蛋白的纯净性，避免了由大肠杆菌表达制 备的P97R1蛋白抗原中杂蛋白对检测敏感性的影响；(2)检测板使用的包被抗 原P97R1蛋白为猪肺炎支原体的特异性蛋白，避免了待检样品中其它猪支原体 或病原的交叉干扰；(3)酶结合物工作液中活性成分为HRP标记的抗猪SC蛋 白单克隆抗体，因此，只有猪肺炎支原体SIgA抗体才能被检测，避免了待检样 品中IgG和IgM抗体的干扰。实验结果也显示本发明试剂盒不会与猪群常见病 毒猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪伪狂犬、H1型猪流感病毒、猪胸膜肺炎、猪鼻 支原体和大肠杆菌SIgA抗体阳性鼻拭子样品产生交叉反应。

2.高稳定性与高敏感性：由于不同批次制备的包被抗原的抗原反应能力不 同，通过抗体捕获包被法制备的检测板确保了不同批次产品的高稳定性，而且保 证了抗体检测板中包被抗原的高反应性，大大提高了试剂盒的高敏感性。

3.样品取样方便：待检样品为鼻拭子，而非血清，实现了无针化采样，减 小了对猪的应激。

4.可区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感染：肌肉注射免疫猪支原体 肺炎灭活疫苗后，只产生血清中的特异性IgG抗体，而无法在呼吸道表面产生特 异性SIgA抗体。猪肺炎支原体的自然感染直接发生在呼吸道靶器管，既可在血 清中产生特异性IgG抗体，又可在呼吸道表面产生很强的特异性SIgA抗体(肺 炎支原体SIgA抗体)。应用本发明提供的试剂盒可在猪支原体肺炎灭活疫苗免 疫场监测感染情况，而目前市场上的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒是无法做到 的。

5.可用于肺炎猪支原体感染的早期诊断：猪肺炎支原体P97R1蛋白等黏附 素吸附到猪支气管上皮细胞是猪肺炎支原体感染宿主的首要步骤，抗猪肺炎支原 体P97R1蛋白抗体也是宿主针对猪肺炎支原体不同蛋白产生的抗体中最早的一 批；宿主应答呼吸道病原感染最先产生的免疫反应为呼吸道的黏膜免疫，然后才 是血液中的全身免疫。SIgA抗体是黏膜免疫中最主要的免疫分子。该试剂盒以 P97R1蛋白为包被抗原，以呼吸道SIgA抗体为检测对象，分别从病原感染步骤 和宿主免疫反应顺序两方面实现了对猪肺炎支原体感染的早期诊断。

6.可用于猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估：猪支原体肺炎 弱毒活疫苗免疫后较难在血清中产生高滴度的特异性IgG抗体反应，暂无法通过 现有商品化的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒对弱毒苗免疫效果进行评估。但弱毒 疫苗免疫却可以在呼吸道产生较高滴度的特异性SIgA抗体，因此，可通过本试 剂盒对弱毒疫苗的免疫效果进行间接评估。

附图说明

图1是猪SC蛋白基因片段的验证电泳图，其中M-DNA marker，1-SC蛋白 PCR产物

图2：(A)重组猪SC蛋白诱导表达SDS-PAGE图.M:蛋白maker.1: BL21-pCold I诱导前菌体；2:BL21-pCold I诱导后菌体；3:BL21-pCold I/SC诱导前 菌体；4:BL21-pCold I/SC诱导后菌体.(B)重组猪SC蛋白存在形式鉴定.M:蛋白 maker.1:BL21-pCold I/SC诱导后裂解液上清；2:BL21-pCold I/SC诱导后裂解液 沉淀.(C)猪重组SC蛋白纯化鉴定图.M:蛋白maker.1:纯化前SDS-PAGE图；2:纯 化后SDS-PAGE图.(D)猪重组SC蛋白的Western blotting鉴定图。

图3是杂交瘤细胞株4H11分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体的特异性鉴定，其中 M:预染蛋白maker，1:猪重组SC蛋白，2:猪天然SC蛋白，3:猪IgA蛋白，4: 猪IgG蛋白。

图4.本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体与商品化单克隆抗体的特异性比 较。A显示本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体的特异性；B显示商品化猪SC 单克隆抗体的特异性；M:蛋白Marker；1：重组SC蛋白，2：猪IgA蛋白；3： 猪IgG蛋白。

图5猪支原体肺炎弱毒疫苗免疫后特异性SIgA抗体的检测结果。

图6猪支原体肺炎弱毒疫苗免疫后血清中特异性抗体检测。

具体实施方式

实施例1制备猪重组SC蛋白

1.猪SC蛋白的RNA提取

样品为猪小肠黏膜上皮细胞、气管上皮细胞或淋巴细胞，或者三者的混合物。

猪小肠黏膜上皮(气管上皮)的处理：小心刮取猪小肠黏膜上皮(气管上皮)， 剪碎，加入500μl的高压灭菌后的PBS缓冲液(0.01M,pH7.2-7.4)后匀浆；

淋巴细胞的处理：取500μl猪血液，加入500μl淋巴细胞分离液(购自上海 华精生物高科技有限公司)，离心(2000rpm条件下20min)，沉淀用500μl高压 灭菌后的PBS缓冲液(0.01M,pH7.2-7.4)重悬；

将处理后的样品采用常规方法提取细胞总RNA

2.扩增猪SC蛋白基因片段

(1)RT-PCR(所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司)：

反应程序为：42℃，60min；95℃，5min。

(2)PCR(所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司)

取RT-PCR产物cDNA进行PCR反应。PCR反应体系如下：

引物1(SEQ ID NO:2)：5’-GCGGAATTCAAGAGTCCCATATTCG-3’；

引物2(SEQ ID NO:3):5’-TTAAGCTTTTTGGAGCCCCC-3’。

反应程序：95℃5min；95℃1min 30s，52-54℃1min 30s，72℃2min， 30cycles；72℃10min，4℃30s。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，成功 扩增出猪SC蛋白基因片段，大小约为1857bp(含引物序列)如图1中箭头所 示。将目的片段用胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)回收。

(3)获得猪SC蛋白基因片段及其序列

将步骤(2)回收的DNA片段与载体pMD 18-T载体(18-T Vector，大 连宝生物工程有限公司)连接。

整个操作过程在冰浴中上进行。载体连接反应体系(连接过程中的试剂购自 大连宝生物工程有限公司)如下：

连接体系混匀后，置于4℃条件下过夜连接

连接产物的转化：

①取连接液10μl全量转化50μl感受态细胞DH5α(大连宝生物工程有限公司)， 在冰中放置30min；

②42℃加热45s后，再在冰中放置1min；

③每管加入500μl预加热(37℃)的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于 37℃，200r/min振荡60min，使细菌复苏；

④取出，离心(5000rpm，3min)，每管剩余100μl菌液铺于含100μg/ml氨苄 霉素(Amp)的LB平板，室温放置20-30min后，37℃倒置培养12-16h，从平板上 挑取白色单菌落，获得阳性重组菌。

重组质粒提取、鉴定及目标基因的测序：将阳性重组菌的单菌落，接种于5ml 含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min条件下培养12-16h。取2ml 菌液提取插入了猪SC蛋白基因片段的重组质粒，用限制性内切酶EcoR I和Hind  III酶切重组质粒，反应体系10μl，各成分如下：

混匀后，置于37℃水浴消化2h。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果显示所挑选重组质粒中成功插入猪SC蛋白基因。将酶切鉴定均为阳性的质 粒命名为pMD 18-T Vector/SC，送至南京思普金生物有限公司测序，猪SC蛋白基 因的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.构建制备猪SC蛋白的重组菌

(1)重组表达质粒pCold I/SC的构建

将pCold I Vector和重组质粒pMD 18-T Vector/SC，同时用EcoR I和Hind III 进行双酶切。酶切体系如下：

将酶切体系在37℃水浴中保温3h后，用1％琼脂糖电泳检测并回收猪SC 蛋白基因酶切片段、载体pCold I酶切片段。将酶切回收片段采用T4连接酶连 接，连接体系如下：

将上述试剂混匀后于4℃过夜连接。将连接产物采用上述相同方法进行转 化，挑选重组质粒，并酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pCold I/SC。

取pCold I/SC 10μL采用常规方法转化感受态细胞BL21(DE3)中，经PCR 和序列鉴定，获得阳性重组菌，命名为BL21-pCold I/SC。同时，将pCold I质 粒转化感受态细胞BL21(DE3)中，得到对照菌BL21-pCold I。

4.猪重组SC蛋白的制备

诱导BL21-pCold I/SC表达猪重组SC蛋白，以BL21-pCold I作为对照，具 体方法如下：

(1)将BL21-pCold I/SC菌液以2％的比例接种含100μg/ml氨苄青霉素(AMP) 的LB液体培养基，在37℃、200rpm条件下培养至OD600值达0.6-0.8时加入 终浓度为1m M的IPTG；

(2)将菌液在15℃放置30min；

(3)将菌液在15℃、200rpm条件下诱导表达24h，收集菌液。

(4)按常规方法将表达产物采用SDS-PAGE电泳检测，结果证实猪重组SC 蛋白被成功表达，蛋白分子量约70kDa(图2A)。

(5)表达产物存在状态分析：

取表达后的细菌沉淀，用pH7.2的PBS缓冲液重悬，超声波破碎2min，直 到菌液变澄清透亮，9000r/min离心15min后分别收集菌体裂解液上清和菌体裂 解液沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定(图2B)，结果证明，重组猪SC蛋白主要以 包涵体形式存在。

(6)猪重组SC蛋白的纯化：采用德国Macherey-nagel公司的Ni-TED 2000镍柱纯化试剂盒纯化猪重组SC蛋白，具体操作按照试剂盒的说明 书进行。

纯化后的猪重组SC蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图2C。可以看到， 纯化后的猪重组SC蛋白纯度达96％。

(7)猪重组SC蛋白的Western blot鉴定：

以羊抗人SC蛋白多抗(美国Santa Cruz公司)为一抗，采用Western blot 对表达产物进行鉴定，结果如图2D所示，证明猪重组SC蛋白具有较好的抗原 反应性。

实施例2制备抗猪SC蛋白单克隆抗体

1.小鼠免疫

将实施例1纯化的猪重组SC蛋白与弗氏完全佐剂(美国Sigma-Aldrich公 司)等体积混合，并充分乳化，皮下多点免疫5只8周龄BALB/c小鼠(扬州大 学比较医学中心)，接种抗原剂量为100μg/只。首免2周后，相同剂量猪重组 SC蛋白与弗氏不完全佐剂(美国Sigma-Aldrich公司)乳化后同途径免疫小鼠， 之后每2周相同方式免疫小鼠，重复3次，直到血清效价达到1:6400以上。细 胞融合前3-5天，腹腔注射加倍量的不含佐剂的抗原加强免疫一次，即可进行细 胞融合。

2.sp 2/0骨髓瘤细胞的准备

融合前20d复苏冻存于液氮中的sp 2/0细胞，1000r/min离心5min后弃上 清，用含20％胎牛血清的DMEM培养基(购自美国Gibco公司)重悬，转入细 胞瓶中，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中传代培养。融合当天取处于 对数生长期，细胞形态均一，边界清晰，生长状态良好的sp 2/0细胞，用无血清 DMEM培养基洗涤后重新悬浮，细胞计数板计数，将细胞稀释为10⁶个/mL，体 积为10mL左右，放置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中融合备用。

3.细胞融合

取标题1中加强免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞，以PEG4000作融合剂， 将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行细胞融合。

4.阳性杂交瘤细胞的筛选

融合后3d观察是否融合上，融合后第4d用HAT培养液(美国Sigma-Aldrich 公司)半量换液，第7d左右改用HT培养液(美国Sigma-Aldrich公司)，同时 进行克隆计数。待杂交瘤细胞长满孔底1/10时，于换液2d后即可取杂交瘤细胞 培养液上清，采用间接ELISA检测上清中抗猪SC蛋白的单克隆抗体的效价，同 时将sp 2/0细胞培养上清液作为阴性对照，免疫猪重组SC蛋白后的小鼠血清做 为阳性对照。对于阳性孔，再用猪重组流感HA蛋白(制备方法同重组SC蛋白， 仅将重组菌中的SC蛋白基因片段换成猪流感HA蛋白基因)包被96孔板后，进 行间接ELISA检测。挑选与猪重组SC蛋白反应呈阳性，与猪重组流感HA蛋白 反应呈阴性的杂交瘤细胞孔作为阳性细胞株。

间接ELISA检测方法：将纯化的猪重组SC蛋白(实施例1制备)包被96 孔板，杂交瘤细胞培养液上清用PBST缓冲液作倍比稀释，SP2/0细胞培养液上 清作为阴性对照，猪重组SC蛋白免疫小鼠的血清作为阳性对照，检测杂交瘤细 胞培养液上清中单抗的效价。

间接ELISA检测方法中的试剂：磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g溶于水，调pH至7.2～7.4,定容至1L。PBST缓冲 液：磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)中含0.05％吐温。包被液是0.05M、pH9.6的碳 酸钠缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水溶解，定容至1000mL。 显色液：将实施例3中的显色液A与显色液B按照体积比为1:40混合即得。终 止液：同实施例3中。

间接ELISA检测方法具体如下：

1.包被：包被液将抗原(纯化后的猪重组SC蛋白)稀释为1μg/ml，加入酶标 板，100μl/孔，37℃作用1h，然后4℃过夜；

2.洗涤：PBST洗涤，300μl/孔，每次5min，洗涤3次，拍干；

3.封闭：含有1％酪蛋白的PBST溶液封闭，100μl/孔，37℃作用2h；

3.洗涤：同2；

4.一抗：

①稀释：在1.5ml EP管里稀释，第一管进行1:100稀释(10μl细胞株培养液 上清+1ml PBST)，以后各管2倍比稀释，即从第一管吸取500μl，加入第二管中 (已含有500μl PBST)，混匀，再从第二管中吸取500μl，加入第三管中，混匀， 以此类推，直至第十二管；同时用PBST作为空白对照，SP2/0细胞培养液上清 作为阴性对照，猪重组SC蛋白免疫小鼠后采集的阳性血清(即收集本实施例步 骤1中免疫后小鼠的血清)作为阳性对照；

②孵育：将上述稀释好的样品分别加入对应孔中，100μl/孔，37℃孵育1h；

5.洗涤：同2；

6.二抗：采用PBST将羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG 抗体，购自武汉博士德公司)进行1:20000稀释，加入各孔中，100μl/孔，37℃ 孵育30min；

7.洗涤：PBST洗涤，300μl/孔，每次5min，共洗涤5次，拍干；

8.显色：加入显色液，100μl/孔，避光显色5min；

9.终止：加入终止液，50μl/孔；

10.检测450nm处的吸光值OD_450nm。以样品OD_450nm≥2.1×阴性对照 OD_450nm，判定为阳性，以杂交瘤细胞株上清最大的阳性稀释度作为单抗的效价。

5.亚克隆

按有限稀释法进行。选择抗体滴度高、克隆数少的孔进行亚克隆3-5次，直 至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％。最终筛选到了杂交瘤细胞株4H11，培 养液上清采用间接ELISA方法检测的效价为1:3200，该杂交瘤细胞株培养液上 清与猪重组SC蛋白反应呈阳性，与猪重组流感HA蛋白反应呈阴性。

杂交瘤细胞株4H11保藏信息如下：

分类命名为：分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11，保藏日 期为2015年3月24日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC， 保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：C201526。

6.杂交瘤细胞的扩大培养与冻存

将杂交瘤细胞株4H11，在24孔细胞板内进行扩大培养，待24孔板中的细 胞长满后，将细胞转入6孔板中培养，然后转入细胞瓶中培养，待细胞长满后传 代培养，同时冻存杂交瘤细胞株。

7.单抗稳定性鉴定

将冻存3个月的杂交瘤细胞株4H11复苏，检测24孔板内培养液上清的效 价，作为评价细胞株是否有分泌抗体能力的指标。结果证实冻存的杂交瘤细胞株 4H11仍能稳定分泌抗猪SC蛋白的单克隆抗体，效价最高达到1:3200。

8.单抗特异性鉴定

采用常规方法从从猪初乳中提取猪天然SC蛋白和猪IgA，从猪血清中提取 猪IgG。将猪重组SC蛋白、猪天然SC蛋白、猪IgA和猪IgG蛋白进行SDS-PAGE 电泳后，转印至PVDF膜上，采用含有3％BSA溶液在4℃封闭过夜。TBST溶 液(取1M、pH8.0的Tris-HCL 10ml，NaCl 4.4g和Tween-20 0.5ml混合，采用去离子水 定容至500ml)洗涤3次，每次5min，加入杂交瘤细胞株4H11的培养液上清， 37℃孵育2h。TBST溶液洗涤3次，每次5min，加入1:10 000倍稀释的羊抗鼠 IgG-HRP(来源同上)，37℃孵育1h。TBST溶液洗涤5次，每次5min，增强化 学发光法(ECL)曝光，拍照，结果如图3所示。从图中可见，杂交瘤细胞株 4H11分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体能与猪重组SC蛋白及猪天然SC蛋白发生 特异性结合反应，而与猪IgA和猪IgG蛋白无交叉反应，特异性较好。

9.抗猪SC蛋白单克隆抗体的大量制备

采取小鼠体内繁殖法大量制备SC单克隆抗体腹水。取12周龄BALB/c繁殖过 母鼠，每只母鼠腹腔注入0.5mL灭菌液体石蜡。7天后，取生长状态良好的杂交 瘤细胞，用高压灭菌后的PBS缓冲液(pH 7.4)调杂交瘤细胞浓度至(4-6)×10⁶个 /ml，腹腔注射接种小鼠，0.5ml/只。1周后，小鼠腹部明显胀大，轻触有波动感， 此时可收集腹水。一般2-3天后，小鼠腹部会再次胀大，可继续收集腹水，每只 小鼠可收集1-3次。将收集到的腹水1500r/min离心10min，取中间层(注意不要吸 到最上层的油状物)，离心取上清液，用Protein A亲合柱(美国GE Healthcare公 司)纯化，得到纯化的抗猪SC蛋白单克隆抗体，-20℃冻存于。

10.抗猪SC蛋白单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记

委托南京金斯瑞生物科技有限公司将杂交瘤细胞株4H11分泌的抗猪SC 蛋白单克隆抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记，采用BCA方法检测酶标 抗体浓度为1.357mg/mL。

11.与商品化单克隆抗体特异性的比较

分别将商品化鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体(购自英国AbD Serotec公司，货 号MCA634)和本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体与猪SC蛋白、猪IgA蛋 白与猪IgG蛋白进行Western blot实验，以比较两种单克隆抗体的特异性。结果 如图4所示。本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体只与猪SC蛋白反应，而与 猪IgA和IgG均不反应(图4A)。商品化鼠抗猪SC单克隆抗体不仅与猪SC蛋 白发生反应，同时与猪IgA和IgG均能发生反应，且与猪IgG反应更强烈(图 4B)。

实施例3猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒

猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒内设有：

1.通过抗体捕获法制备包被了猪肺炎支原体P97R1蛋白的抗体检测板

(1)猪肺炎支原体P97R1蛋白的制备：

按文献(刘茂军，邵国青，张映，聂向庭.猪肺炎支原体P97基因抗原决定 簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005.21(3):207-11)构建携带猪肺炎支原 体P97基因抗原决定簇R1区基因片段的重组菌。将该重组菌接种至含有氨苄青 霉素的LB液体培养基，于37℃、180rpm摇床内培养，待达OD₆₀₀＝0.6～0.8时 加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达，继续培养1～5h后收集菌体， 用PBS(pH7.2)洗涤1次，将菌体悬液用溶菌酶和超声波裂解，在4℃下5 000rpm 离心30min，取裂解液上清，用His-Tag亲合层析柱(MERCK公司产品)分离纯 化，得到重组猪肺炎支原体P97R1蛋白，采用BCA方法检测蛋白浓度。-20℃ 保存备用。

(2)抗猪肺炎支原体P97R1蛋白的单克隆抗体的制备

按文献(冯志新，刘茂军，王海燕，甘源，吴叙苏，邵国青.猪肺炎支原体 黏附因子P97R1区单抗制备.江苏农业学报.2009.25(6):1438-1441.)，采用杂交瘤 细胞株6C5制备抗猪肺炎支原体P97R1蛋白的单克隆抗体，并用ProteinA亲合 柱(美国GE Healthcare公司)纯化，采用BCA方法检测抗体浓度。

(3)抗体检测板的制备

按方阵滴定法，确定抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体的最佳包被浓 度为2.0μg/mL，捕获抗原重组P97R1蛋白的最佳包被浓度为2μg/mL。用 0.05mol/L、pH值9.6的碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g,用蒸馏水 溶解，加蒸馏水定容至1000mL)将纯化的抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗 体稀释至2.0μg/mL，按每孔100μL包被检测板，2-8℃作用12-18h。弃去孔中的 包被液，用PBST(10×浓缩洗涤液稀释10倍)洗涤3次，每次3-5min。每孔 加入200μL含有10g/L酪蛋白的PBS溶液(取8g NaCl、0.2g KCl、2.9g  Na₂HPO₄·12H₂O和0.24g KH₂PO₄溶于蒸馏水，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.4) 进行封闭，置37℃孵育2h后弃去。用PBST(10×浓缩洗涤液稀释10倍)洗 涤3次，甩干。按100μL/孔加入2μg/mL纯化的重组猪肺炎支原体P97R1蛋白 溶液，置37℃孵育1h后弃去，用PBST(10×浓缩洗涤液稀释10倍)洗涤3次， 每次3-5min，拍干。每孔加入150μL的50g/L蔗糖溶液，置37℃孵育1h后 弃去。用PBST(10×浓缩洗涤液稀释10倍)洗涤3次，甩干后抽真空密封， 置2-8℃保存。

2.10×酶结合物工作液

将实施例2制备的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪SC蛋白单克隆抗体， 采用BCA方法检测酶标抗体浓度，并调整浓度为1mg/mL。然后用PBST(10 ×浓缩洗涤液稀释10倍)作1：1000稀释，加终浓度为25μg/ml庆大霉素，用 0.22μm滤膜过滤除菌，得到10×酶结合物工作液，无菌分装，1.2ml/支，2～8℃ 保存。

3.阳性对照液

取自人工感染猪肺炎支原体Js株的试验猪肺泡灌洗液。感染猪的血清用 IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒(即HerdChek Mycoplasma  hyopneumoniae ELISA抗体检测试剂盒，用于检测血清IgG抗体，下同)检测为 阳性，肺泡灌洗液沉淀经猪肺炎支原体套式PCR(逯晓敏，冯志新，刘茂军， 吴叙苏，甘源，张映，邵国青.猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用. 江苏农业学报.2010.26(1):91-95.)检测为阳性，肺脏剖检尖叶、心叶、中间叶和 膈叶前缘呈“胰样”或“虾肉样”气喘病典型病变，判定为感染成功。将肺泡灌洗液 经10,000rpm离心30min，取上清，0.22μm滤器过滤除菌后加入终浓度为0.01％ (质量百分浓度)的硫柳汞，作为阳性对照液，无菌分装1ml/管，2～8℃保存。

4.阴性对照液

取自于猪肺炎支原体阴性健康猪的肺泡灌洗液。试验猪血清经IDEXX公司 的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测为阴性，剖杀后肺脏无气喘病典型病变，用 套式PCR检测肺泡灌洗液沉淀中猪肺炎支原体抗原为阴性，判定为猪肺炎支原 体阴性健康猪。将肺泡灌洗液经10,000rpm离心30min，取上清，0.22μm滤器过 滤除菌后加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，作为阴性对照液，无 菌分装1ml/管，2～8℃保存。

5.10×浓缩洗涤液

取40g NaCl、1.0g KCl、14.5g Na₂HPO₄·12H₂O、1.2g KH₂PO₄、2.5ml吐温-20 溶于去离子水，定容至500ml。加终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞， 用0.22μm滤膜过滤除菌，作为10×浓缩洗涤液，无菌分装，30ml/瓶。

6.显色液A

21mg TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，购自BIOSHARP公司)溶于5ml无水 乙醇，混匀分装，1ml/支，作为显色液A。

7.显色液B

33mg UHP(过氧化脲素，购自上海晶纯生化科技股份有限公司)溶于200ml、 pH为5.2的磷酸盐缓冲液(取2.7g Na₂HPO₄·12H₂O、13.2g KH₂PO₄溶于去离子 水，定容至500ml)，加终浓度为25μg/ml的庆大霉素，用0.22μm滤膜过滤除菌， 无菌分装，15ml/瓶，作为显色液B。

8.终止液

终止液为2mol/L的硫酸溶液。

本发明试剂盒检测的样品为待检猪鼻拭子样品。本发明试剂盒储存于4-7℃ 条件下。

实施例4猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒的检测操作程序

本实施例说明实施例3制备的猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒的 检测操作程序。

1.试剂配制

(1)检测前，将猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒内所有试剂 在室温下放置30分钟，使所有试剂恢复至室温。

(2)1×洗涤液配制。恢复至室温的10×浓缩洗涤液，如有沉淀可在37℃ 温浴5～10分钟，用灭菌纯水稀释10倍，即为1×洗涤液，2～8℃保存7日。

(3)1×酶结合物工作液。将10×酶结合物工作液用1×洗涤液稀释10倍， 备用。

(4)底物显色液配制。显色液A与显色液B按照体积比为1:40进行混合， 得到底物显色液，备用。

2.检测操作程序

(1)取抗体检测板，设置阴性对照孔、阳性对照孔和样品检测孔，每孔 做一个重复。在阴性对照孔内加入阴性对照液，在阳性对照孔中加入阳性对照液， 在样品检测孔中加入待检鼻拭子样品，加入量均为100μL/孔。

(2)将加样后的抗体检测板置37℃温育120分钟。

(3)弃去抗体检测板孔中的液体，各孔加入1×洗涤液250μL进行洗涤， 洗涤5次。注意，最后一次洗涤后，要将抗体检测板甩干，在吸水材料上用力拍 干，去掉剩余的液体。

(4)每孔加入1×酶结合物工作液100μL，置37℃温育60分钟。

(5)重复步骤(3)。

(6)每孔加入100μL底物显色液，37℃温育避光显色7分钟。

(7)每孔加入50μL终止液，终止反应。

(8)用酶标仪测量和记录样品检测孔和对照孔在450nm处的吸光值 (OD₄₅₀值)。

3.结果判定

当1.2＜阳性对照孔OD₄₅₀值＜2.0，且0.05＜阴性对照孔OD₄₅₀值＜0.25时， 试验结果可靠。

根据样品S/P＝(样品检测孔OD₄₅₀值-阴性对照孔OD₄₅₀值)/(阳性对照孔 OD₄₅₀值-阴性对照孔OD₄₅₀值)，计算样品S/P。当样品S/P≥0.17判为阳性，说 明待检猪感染猪肺炎支原体野毒或疫苗毒；当样品S/P＜0.17判为阴性，说明待 检猪未感染猪肺炎支原体。

实施例5猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒的特异性

1.鼻拭子样品

鼻拭子样品包括150份猪肺炎支原体SIgA抗体阴性鼻拭子样品和7份其他 呼吸道病原阳性的鼻拭子样品。

150份猪肺炎支原体SIgA抗体阴性鼻拭子样品：采集自没有免疫任何猪肺 炎支原体疫苗且近2年未发生猪支原体肺炎的猪场，其对应的血清抗体采用 IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测均为猪肺炎支原体抗体阴性。

7份其他呼吸道病原阳性的鼻拭子样品：包括猪呼吸与繁殖综合征病毒 (PRRSV)SIgA抗体阳性猪鼻拭子，猪伪狂犬(PRV)SIgA抗体阳性猪鼻拭子， H1型猪流感病毒(SIV)SIgA抗体阳性猪鼻拭子，猪胸膜肺炎(APP)SIgA抗 体阳性猪鼻拭子，猪鼻支原体(MHR)SIgA抗体阳性猪鼻拭子，大肠杆菌(E.coli) SIgA抗体阳性鼻拭子，猪肺炎支原体(MHP)SIgA抗体阳性鼻拭子。

2.检测方法

对上述157份样品同时采用方法A和B进行检测。

方法A：采用实施例3中方法制备的猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试 剂盒按照实施例4中方法检测上述各样品是否与该试剂盒发生非特异性反应，计 算阴性检出率。

方法B：采用申请号为2009100257043、名称为抗猪肺炎支原体SIgA间接 ELISA检测方法的发明专利申请中公开方法，检测上述各样品是否与该方法发生 非特异性反应，计算阴性检出率。

3.结果

结果显示：本发明试剂盒对7份其它病原抗体均无交叉反应，对150份MHP 阴性品检出率高达97.3％(146/150)，见表1。申请号为2009100257043、名称 为抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA检测方法的发明专利申请中公开的方法，对 150份MHP阴性品检出率仅仅只有92.7％(139/150)，最大的缺陷在于该方法对 大肠杆菌抗体存在交叉反应，见表2。

表1方法A的特异性

注：S/P值≥0.17为阳性，S/P值＜0.17为阴性。“-”表示阴性，“+”表示阳 性。

表2方法B的特异性

注：S/P值≥0.15为阳性，S/P值＜0.1为阴性，当0.1≤S/P值＜0.15时为可疑。 “-”表示阴性，“+”表示阳性。

实施例6猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒区分猪支原体肺炎灭 活疫苗免疫和自然感染

1.样品

来自4个猪场的260头猪，分别采集每头猪的鼻拭子样品和血清样品，各共 计260份。其中，A猪场没有免疫任何猪肺炎支原体疫苗，近2年未发生猪支原 体肺炎；B猪场免疫猪肺炎支原体灭活疫苗，未发现猪支原体肺炎临床症状；C 和D猪场没有免疫任何猪肺炎支原体疫苗，70％以上的猪存在咳嗽，气喘，腹式 呼吸等猪支原体肺炎临床症状。

2.检测方法

(1)血清IgG抗体检测：试验方法严格按照IDEXX公司的猪肺炎支原体 抗体检测试剂盒的说明书操作步骤进行。

(2)猪肺炎支原体SIgA抗体检测，采用实施例3中方法制备的猪肺炎支 原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒按照实施例4中方法检测。

(3)猪肺炎支原体抗原检测：按文献(逯晓敏，冯志新，刘茂军等.猪肺 炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用.江苏农业学报.2010.26(1):91-95)方法 采用套式PCR检测猪肺炎支原体。

3.结果

结果如表3所示，四个猪场中三种检测方法结果差异最大的出现在B猪场。 对于B猪场，猪肺炎支原体SIgA抗体与猪肺炎支原体抗原检测结果的阳性率均 较低，符合率较高；而IDEXX公司的ELISA抗体检测试剂盒检测的血清IgG抗 体阳性率很高，与其他两种指标检测结果符合率非常低。一般情况下，猪肺炎支 原体灭活疫苗免疫后，猪只产生较高的血清IgG抗体，较难产生或只产生低水平 的黏膜SIgA抗体；自然感染猪肺炎支原体的猪，可产生较高的血清IgG抗体与 黏膜SIgA抗体。因此B猪场的猪肺炎支原体SIgA抗体阳性率较低，C、D猪场 猪肺炎支原体SIgA抗体的阳性率较高。通过套式PCR对猪肺炎支原体抗原的检 测结果分析证明，本发明的试剂盒可以检测出自然感染猪肺炎支原体的猪，不能 检测出接种猪支原体肺炎灭活疫苗的猪，即本发明试剂盒可以区分猪支原体肺炎 灭活疫苗免疫和自然感染。

表3.猪肺炎支原体抗体/抗原检测阳性率统计

实施例7猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒用于猪支原体肺炎弱毒 活疫苗免疫效果的评估

1.样品

来源于肺内免疫猪支原体肺炎弱毒活疫苗(南京天邦生物科技有限公司)的 猪在不同时间点采集的鼻拭子样品和血清样品。

2.检测方法

(1)血清抗体检测：试验方法严格按照IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检 测试剂盒的说明书操作步骤进行。

(2)猪肺炎支原体SIgA抗体检测：采用实施例3中试剂盒按照实施例4 中方法检测。

3.结果

如图5所示，采用实施例3中试剂盒可有效检测到猪支原体肺炎弱毒活疫苗 免疫后猪呼吸道中产生的特异性SIgA抗体分泌，且抗体滴度在免疫后出现一定 的升高与下降的规律。而图6结果表明，猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫后较难从 血清中检测到抗体转阳(S/P>0.4为阳性)。此实施例结果证明，本发明试剂盒可 以对猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫效果进行间接的评估。

实施例8猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒的敏感性

1.鼻拭子样品

135份临床猪鼻拭子，均采集自没有免疫任何猪肺炎支原体疫苗的猪场，70％ 以上的猪存在咳嗽，气喘，腹式呼吸等猪支原体肺炎临床症状，其对应猪的血清 抗体经IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测均为猪肺炎支原体IgG 抗体阳性。另61份阳性鼻拭子为人工感染猪肺炎支原体Js株后28天采集的猪 鼻拭子样品。

2.检测方法

按照实施例3制备三批试剂盒(批号分别为001，002，003,以下简称为本发 明试剂盒)，并检测所有样品中是否含有猪肺炎支原体SIgA抗体，计算阳性检 出率。另选择人工感染样品中滴度较高的5份阳性鼻拭子样品，检测总蛋白浓度， 并做1:2～1:64连续2倍比稀释后用实施例3中试剂盒检测，计算最低检出量。

同时用申请号为2009100257043(名称为抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA 检测方法)的发明专利申请中公开方法检测猪肺炎支原体SIgA抗体，计算阳性 检出率与最低检出量。

3.结果

采用三批次本发明试剂盒检测临床采集的196份猪肺炎支原体阳性临床鼻拭 子样品，其阳性率分别为192/196(98.0％)，191/196(97.4％)，191/196(97.4％)。 采用申请号为2009100257043(名称为抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA检测方法) 的发明专利申请中公开方法检测，阳性数为180/196，阳性率仅仅只有91.8％，见 表4。

选择5份人工感染阳性鼻拭子样品(Ps1～5)测定蛋白浓度，并2倍比稀释后， 分别用本发明试剂盒(批号002)和申请号为2009100257043的发明专利申请中公 开方法检测猪肺炎支原体SIgA抗体。结果显示，本发明试剂盒对猪肺炎支原体 SIgA抗体阳性鼻拭子样品最低的检出浓度为42.50～48.75μg/ml，最大检出稀释倍 数为1:16(见表5)。采用申请号为2009100257043发明专利申请中公开方法检测， 对猪肺炎支原体SIgA抗体阳性鼻拭子样品最低的检出浓度为170.00～390.00μ g/ml，最大检出稀释倍数为1:2～1:4(见表6)。

表4本发明的试剂盒与已公开的抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA检测方法 检测临床样品统计结果

表5本发明试剂盒对人工感染阳性鼻拭子样品的最低检出浓度

注：S/P值≥0.17为阳性，S/P值＜0.17为阴性。

表6 2009100257043发明专利申请方法对人工感染阳性鼻拭子样品的最低检 出浓度

注：S/P值≥0.15为阳性，S/P值＜0.1为阴性，当0.1≤S/P值＜0.15时为可疑。

实施例9猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒稳定性

考察实施例3制备的猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒的稳定性。

1.批内重复性试验

用同一批次的5个试剂盒(Kit1-Kit5)对10份猪肺炎支原体SIgA抗体阴性鼻 拭子样品(1～10)和10份猪肺炎支原体SIgA抗体阳性鼻拭子样品(11～20)进行 平行试验。

2.批间重复性试验

用3个批次试剂盒(001，002，003批)对10份猪肺炎支原体SIgA抗体阴性 鼻拭子样品(1～10)和10份猪肺炎支原体SIgA抗体阳性鼻拭子样品(11～20)进 行平行对比试验。

本实施例标题2和标题1中样品来源及编号相同。

3.结果

实验结果显示，用同一批次的5个试剂盒检测10份阴性鼻拭子和10份阳性鼻 拭子的批内变异系数C.V.％分别在1.99％～9.99％(见表7)；用3个批次的试剂盒检 测10份阴性鼻拭子和10份阳性鼻拭子的批间变异系数在1.17％～9.90％(见表8)。 批内试验与批间试验结果证明本发明的试剂盒具有良好的稳定性。

表7批内不同试剂盒检测猪肺炎支原体SIgA抗体的试验结果

表8不同批次试剂盒检测猪肺炎支原体SIgA抗体的试验结果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒

       方面的应用

 

<130>  20150512

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1842

<212>  DNA

<213>  猪

 

<400>  1

aagagtccca tattcggtcc ccaggatgtg agcagcgtgg aaggcagctc ggtgtccatc     60

 

agatgctact acccagccac ctccgtcaac cggcattctc ggaagtactg gtgccgaata    120

 

ggagccaagg gccgctgcac aaccctcatc tcctcggagg gctacatctc caaggactac    180

 

aagggcagag ccaacctcac caacttccca gagaacggca ccttcgtgat ggacattggc    240

 

cacctgaccc gcggtgactc tgggctctac aagtgtggtc tgggcattag cagccgaggc    300

 

ctgtcttttg acgtgagcct ggaggtcagc caaggtcctg gacagatagg tgatgtccac    360

 

gtctacacag cagacctggg cagcacagta accatcaact gccctttcaa gtctgagaat    420

 

gctcagaagc cgaaatccgt gtacaagaaa ctgggccaga tccgcgtcct ggtcatcgac    480

 

tccaatgggt atttgaacaa caactttacc aacagagcac atctcagtat tcagggtacc    540

 

aaccaattag tattcagctt tgtcatcaac cgaatccagc tccgcgatgc tgggatatac    600

 

atctgccagg ctggggacga agagagcagc gctgacctcc aagtgctgaa gcccgagcct    660

 

gagctgattt atggagacct gaggggctcg gtgacatttg actgcgccct gggccaggag    720

 

atggcaaatg tggccaaatt tctgtgccag ctaaaaaatg ggaaaacctg caatgtggtc    780

 

atcaacaccc tggggaagaa ggctcaggac tttgagggca ggatcctgct cactcccaag    840

 

gaaaacagcc acttcagcgt gcacatcacc gggctgcgga aagaggacgc aggacactac    900

 

ctgtgcggag cccaccctga cggtgagcct aaggaaggct ggccggtcca ggcttggcag    960

 

ctcttcatca atgaagatac tatgattccc ccaagatcct ccgtggtgag aggtgtggtg   1020

 

ggaggctccg tggccgtgac ctgcccctac aacccgaagg aaacaaacag cctgaagtac   1080

 

tggtgtcgct gggaagagaa tgaaaacggc cgctgcccgc agctggtgga aagcagcggg   1140

 

ctagtgaacg agcaatacga gggccggctc gcgctgtacg aggagccagg caatggcacc   1200

 

ttcacggtca tactcaacca gctcaccaac cgggacgccg gcttctactg gtgtttgacc   1260

 

aacgaggact ctcgctggag gtccaccgta gagctcaaga ttgttgaagg agaaccgaac   1320

 

ctcaagctac ccgagaatgt caccgcttgg gtgggagaga ccctcaagct ctcctgccac   1380

 

ttcccatgca aattctactc ctaccagaag tactggtgta agtggagcaa caccggctgc   1440

 

agggccctgc ccagccagga cgaaggccag agccaggcct ttgtgaactg tgacaagaag   1500

 

agccagatca tctccctgaa cctgaaccct gtcagaaagg aggatgaagg ctggtactgg   1560

 

tgcggggtga aggacggact ccactacgga gagactgggg ctgtctacgt ggcagtggaa   1620

 

cagaaggcaa aggggtcggg agatgcccgt ctagcaaatg ctgctcctgc tcctgctgaa   1680

 

gacgcaatag agccaagggc cagggagact gagaacgagg tcctcctgga tcccagcctc   1740

 

attgcagagg acagagcagt gaaggatggt gaaggcccag ctagtgggag tggagtacct   1800

 

gcagcccctg gcagctctgt gggccaaggc gggggctcca aa                      1842

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  artificial

 

<220>

<223>  引物1

 

<400>  2

gcggaattca agagtcccat attcg                                           25

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artificial

 

<220>

<223>  引物2

 

<400>  3

ttaagctttt tggagccccc                                                 20