番茄斑萎病毒核衣壳蛋白与病毒基因组RNA互作分子机制研究

摘要

番茄斑萎病毒属（Tospovirus）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）唯一能够侵染植物的病毒属，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是该属病毒典型种。TSWV能够引起多种农作物和观赏植物发生严重病害，在全世界范围内有广泛分布。 TSWV核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）是病毒主要的结构蛋白，负责装配病毒基因组RNA形成核酸蛋白复合体（ribonucleoprotein complexes，RNPs）。TSWV以及其它布尼亚病毒科病毒的RNPs是病毒基因组复制和基因转录的模板，而不是裸露的基因组RNA。因此，RNPs是TSWV病毒循环复制的中心。前人通过酵母双杂交分析，TSWV N单体之间可以通过头尾相连的方式互作，TSWV N也可以与单链RNA非特异性结合，但是TSWVN蛋白单体之间互作以及N与基因组RNA互作的分子机制并不清楚。另外，尽管N的两端区域与RNA结合有关，但是N结合RNA的关键氨基酸位点还未鉴定。N能够结合病毒基因组RNA，但是对其保护RNA的功能也不清楚。因此，N单体之间的互作与其结合RNA特性之间的关系仍需要进一步阐述和说明。蛋白质晶体结构是研究其生物学功能的有效手段，番茄斑萎病毒属有20多种病毒，没有一例N蛋白的晶体结构被解析。而人类或动物布尼亚科病毒N蛋白的结构近年来被陆续解析，基于这些数据，本研究中构建了TSWV N的同源模型，通过N蛋白3D结构我们得到了一些有价值的线索，开展了N蛋白结合基因组RNA分子机制的研究。本研究取得了以下三个方面的研究结果: 1.TSWV N体外能形成不同大小的多聚体状态 通过聚丙烯酰胺非变性电泳等方法，我们发现番茄斑萎病毒核衣壳蛋白在体外能形成不同大小的多聚体状态，如单体、二体、三体、四体、五体等。进一步研究发现TSWV N C末端缺失26个氨基酸或者位于该区域的保守苯丙氨酸突变后影响N蛋白形成高聚合状态多聚体的能力。通过分离N蛋白不同大小的多聚体，发现TSWV N蛋白的多聚体不能稳定的单独存在，单体蛋白能够重新聚合形成二体，二体蛋白能够重新解聚形成单体，三体和四体也能够解聚形成更低聚状态的蛋白聚合物。 2.TSWV N结合基因组RNA关键氨基酸位点及N保护RNA特性 通过聚丙烯酰胺非变性电泳对TSWV N结合RNA特性进行分析表明，尽管三聚体所占比例丰富，但没有特定的核衣壳多聚体类型可以优先地结合RNA。对N多聚体结合的细胞RNA进行分离分析进一步显示，核衣壳蛋白的每一个多聚体类型都可以结合RNA。竞争实验表明，N对病毒基因组末端序列RNA并未表现出优先结合。为了进一步展现核衣壳蛋白与RNA互作的结构及功能特征，我们构建了核衣壳蛋白、以及核衣壳蛋白和RNA复合体的同源模型。基于这些模型，我们证明了一些位于预测模型裂槽的带正电荷氨基酸和极性氨基酸对于核衣壳蛋白结合RNA是非常关键的。此外，从核衣壳蛋白和RNA复合体的同源模型中，我们发现RNA被深入包埋于预测的蛋白质裂槽内，与这一现象相一致的是我们发现核衣壳蛋白和RNA复合体可以在一定程度上保护RNA不被RNase消化，结合RNA的能力会影响其保护RNA的特性。 3.TSWV N多聚体状态与其结合保护基因组RNA的关系 通过去除TSWV N中非特异性结合的大肠杆菌RNA，以及鉴定得到RNA结合缺陷型突变体，我们发现TSWVN蛋白形成不同状态多聚体并不依赖与RNA结合。通过RNA保护试验分析，我们发现TSWV N形成多聚体状态的能力影响其结合和保护基因组RNA的能力。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．番茄斑萎病毒属病毒概述

1．1病毒发生和寄主范围

1．2病毒的传播

1．3分子生物学特性

1．4病毒转录与复制

2负义单链RNA病毒核衣壳蛋白与RNA互作特性

2．1核衣壳蛋白特异性识别病毒基因组RNA末端序列

2．2核衣壳蛋白结合mRNA帽子结构后特异性识别病毒基因组RNA

2．3核衣壳蛋白结合病毒其他蛋白后特异性识别病毒基因组RNA

2．4核衣壳蛋白具有RNA分子伴侣(RNA chaperone)活性

3 布尼亚病毒科病毒核衣壳蛋白晶体结构揭示包壳机制

第二章番茄斑萎病毒核衣壳蛋白与基因组RNA相互作用分子机制研究

1．材料与方法

1．1菌株、质粒和主要试剂

1．2载体构建

1．3目的基因PCR扩增

1．4 PCR产物的纯化

1．5双酶切体系

1．6连接体系

1．7利用限制性内切酶Dpn I进行突变体快速构建方法

1．8大肠杆菌高效DH5α感受态制备和转化

1．9菌落PCR筛选阳性克隆

1．10 大肠杆菌质粒DNA抽提方法

1．11 测序及结果分析

1．12 感受态细胞Rosstta(DE3)制备及转化

1．13 蛋白质原核表达及其纯化

1．14 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．15 不连续的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-Blue PAGE)

1．16 蛋白质定量方法

1．17 TEV切除6×His蛋白标签方法

1．18 RNA体外转录

1．19 RNA探针地高辛标记反应体系

1．20 RNA纯化回收

1．21 蛋白质中RNA电泳分析方法

1．22 蛋白质体外交联

1．23 凝胶电泳阻滞分析

1．24 蛋白质免疫印迹

1．25 蛋白质同源建模

1．26 蛋白质序列多重比对

2结果与分析

2．1番茄斑萎病毒自身互作形成多聚体研究

2．2番茄斑萎病毒核衣壳蛋白结合单链RNA特性

2．3番茄斑萎病毒核衣壳蛋白形成多聚体与其结合保护RNA能力的关系

3讨论

4全文总结

5本研究创新点

6本研究不足之处

参考文献

附录

致谢