番茄斑萎病毒(TSWV)dsRNA介导的分子免疫调控作用研究

摘要

番茄斑萎病毒(TSWV)是布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)唯一侵染植物的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的病毒之一。分布于世界各地,对许多作物及植物造成巨大经济损失,加之难以防治。所以本研究主要从dsRNA介导的分子免疫调控方面来研究防治该病毒的方法。
　　 根据已报道的TSWV基因序列,设计通用引物,通过RT-PCR扩增了TSWV N基因和GN/GC基因的全长序列,并分别克隆到pGEM-T载体上,经PCR筛选和酶切鉴定与预期结果一致,对TSWVN基因和GN/GC基因进行测序,经过与GeneBank所登录的其他株系比对后,结果表明,N基因核苷酸序列与来自South Korea的三个株系的N基因核苷酸序列的一致率最高,达99％；GN/GC基因核苷酸序列与来自Spain的两个株系的GN/GC基因核苷酸序列一致率也高达99％。这说明:本研究中的材料在侵染寄主植物时发生了基因组重组的现象。
　　 根据克隆得到的TSWVN基因的序列,设计新的引物,引入需要的限制性内切酶酶切位点(AscI,SwaI,BamHI,SpeI),分别扩增313bp和536bp的片段。用于构建反向重复片段的植物表达载体。扩增N基因反向片段的引物时,在5'端引入限制性酶切位点SpeI,在3'端引入限制性酶切位点BamHI,扩增N基因正向片段时,在5'端引入限制性酶切位点.AscI,在3'端引入限制性酶切位点SwaI,以中间载体pFGC1008自身的一段序列为内含子,构建反向重复dsRNA的载体,以pCAMBIA1304为构建反向重复dsRNA的植物表达载体,通过PCR、酶切、测序等方法验证,均表明构建的重组载体与预期相同。
　　 利用农杆菌介导法将构建好的反向重复dsRNA植物表达载体转化烟草,转化结果有待进一步分析鉴定。