BDNF基因真核表达载体的构建及BDNF-GFP融合蛋白对神经干细胞增殖、分化影响的研究

摘要

目的: 通过构建SD大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的真核表达载体pEGFP-N1-BDNF，并将其转染到胎鼠神经干细胞(NSCs)中，观察转染的NSCs中BDNF-GFP融合蛋白的表达、以及融合蛋白对NSCs细胞的增殖和分化的影响，为下一步进行NSCs移植治疗脑损伤及退行性脑疾病提供实验准备。 方法: 通过设计BDNF的特异性引物，用RT-PCR的方法从SD大鼠海马组织中获取BDNF基因序列片段，将其克隆入真核细胞表达载体pEGFP-N1中，通过PCR、双酶切鉴定后，选出阳性克隆进行DNA测序鉴定。将构建成功的pEGFP-N1-BDNF重组质粒用脂质体转染法分别转染COS-7细胞和NSCs细胞。以转染空质粒pEGFP-N1和未转染的细胞作为对照。用RT-PCR检测BDNFmRNA表达情况；用免疫印迹、ELLAS法检测BDNF-GFP融合蛋白表达情况；用MTT比色法和免疫细胞化学方法研究BDNF-GFP融合蛋白对NSCs细胞增殖和分化的影响。 结果: 1.重组质粒通过质粒PCR、双酶切后电泳显示存在与BDNF目的基因大小相同的条带，DNA测序结果显示与Genebank公布的BDNF基因序列比较只有一个突变位点，但不影响正常BDNF蛋白的表达。 2.重组质粒转染COS-7细胞后，RT-PCR鉴定显示只有转染pEGFP-N1-BDNF的COS-7细胞有BDNF mRNA表达：免疫印迹检测显示，仅转染pEGFP-N1-BDNF的COS-7细胞有BDNF-GFP融合蛋白表达，在48h以未成熟BDNF-GFP融合蛋白表达为主，在96h以成熟BDNF-GFP融合蛋白表达为主。 3.重组质粒转染NSCs细胞后，RT-PCR鉴定显示只有转染pEGFP-N1-BDNF的NSCs细胞有BDNF mRNA表达；ELLAS检测显示，转染pEGFP-N1-BDNF的NSCs细胞在72-96h分泌的BDNF-GFP融合蛋白的量达高峰；MTT结果提示BDNF-GFP融合蛋白有抑制神经干细胞增殖的作用；免疫细胞化学检测显示BDNF-GFP融合蛋白能够促进神经干细胞向神经元样细胞分化。 结论: 1.成功构建了pEGFP-N1-BDN真核表达载体。 2.COS-7细胞和NSCs细胞转染pEGFP-N1-BDN后，均能表达BDNF-GFP融合蛋白。 3.BDNF-GFP融合蛋白的表达能够促进神经干细胞向神经元样细胞分化，但却有抑制神经干细胞增殖的作用。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分：BDNF基因真核表达载体pEGFP-N1-BDNF的构建及鉴定

材料和方法

1.材料

2.方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

第二部分：BDNF-GFP融合蛋白对转染后NSCs的增殖和分化的影响

材料与方法

1.材料

2.方法

3.统计学分析

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

脑源性神经生长因子与中枢神经系统疾病

攻读硕士学位期间完成的学术论文和综述

致谢