PD-LI质粒构建及转染小鼠树突状细胞抑制异系T淋巴细胞增殖的实验研究

摘要

目的:克隆小鼠PD-L1(mPD-L1)全长cDNA,构建其真核表达载体,并验证其在小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)中的表达:研究经PD-L1基因转染小鼠树突状细胞对异系小鼠T淋巴细胞增殖的影响;并为进一步研究PD-L1基因在移植排斥中的保护作用打下基础。
　　 方法:
　　 1.pTracer-PD-L1真核表达载体的构建:采用RT-PCR和TA克隆技术,从小鼠CT26细胞中扩增mPD-L1全长cDNA,片段两侧添加KpnI/XbaI酶切位点,克隆至pMDl9-T Simple载体,测序。采用限制性内切酶Kpnl、XbaI将目的基因片段亚克隆至pTracer-CMV2表达载体,提取重组质粒进行酶切鉴定,并对阳性克隆的基因进行测序。
　　 2.制备稳定表达PD-L1蛋白的小鼠骨髓源DC:体外分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖刺激下,筛选、培养、扩增小鼠骨髓源性树突状细胞,通过细胞形态、组合性表面分子标志表达对其进行鉴定。脂质体转染PD-L1基因至小鼠成熟DC,流式细胞术检测转染前后PD-L1蛋白表达。
　　 3.研究改变小鼠DC的PD-L1表达对异系T淋巴细胞增殖的影响:分离Babl/C小鼠的淋巴细胞,用羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,将C57BL/6小鼠的DC分为3组:未转染组(A组)、空载体转染组(B组)、PD-L1转染组(C组)和异系Babl/C小鼠淋巴细胞混合培养,流式细胞术观察淋巴细胞的增殖情况。
　　 结果:
　　 1.酶切鉴定PD-L1基因成功正向插入pTracer质粒载体,经测序证实所得的mPD-L1cDNA序列与其在GenBank中的序列完全一致。
　　 2.经体外培养,每只小鼠可获1.5-2×107 DCs,经脂质体转染PD-L1的DC较未转染DC,PD-L1蛋白表达明显升高,在未转染DC,转染空白质粒DC和转染PD-L1的DC,PD-L1蛋白表达率分别为(5.43±1.08)％,(7.29±0.76)％和(45.79±2.07)％。
　　 3.将转染了PD-L1的小鼠DC与异系Babl/C小鼠的T淋巴细胞进行共培养,与对照组相比,转PD-L1质粒DC组未分裂细胞数明显升高,明显地抑制了异系T淋巴细胞的增殖。
　　 结论:
　　 1.成功克隆了mPD-L1基因,构建其真核表达载体,为深入研究PD-L1生物学功能奠定基础。
　　 2.培养基选择法可收获大量骨髓源性DC,具有典型形态,高表达共刺激分子。脂质体转染PD-L1基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达PD-L1蛋白。
　　 3.转染小鼠DC后通过共刺激通路PD-1/PD-L1抑制了异系小鼠T淋巴细胞的增殖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

前言

材料和方法

1.材料

2.方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

综述:T细胞共刺激途径在移植物排斥和耐受中的进展

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

临床培训小结

致谢