乳鼠骨髓来源间充质干细胞抑制树突状细胞成熟和T淋巴细胞增殖的实验研究

摘要

目的：初步研究小鼠乳鼠骨髓源性间充质干细胞(BM-MSCs)的分离培养、纯化方法,并进行细胞表面标志和体外分化能力的鉴定;检测骨髓源性间充质干细胞对于树突状细胞(DCs)抑制成熟的作用,以及对异体T淋巴细胞的抑制作用。
　　方法：全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6乳鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),经过传代纯化后的第四代细胞,流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD29、CD105、MHC-Ⅱ抗原的表达;同时取第四代细胞体外诱导向成脂、成骨方向分化以鉴定MSCs。获取Balb/c小鼠骨髓细胞,在含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(20μg/L)和重组小鼠白细胞介素4(IL-4,10μg/L)的完全培养基中对其进行诱导培养及扩增,培养至第8天收获DCs;实验分为4组:单纯对照组,LPS刺激组,DCs加MSCs共培养组,LPS刺激的DCs加MSCs共培养组;用流式细胞学检测DCs的表面标志CD11C、CD86、MHC-Ⅱ的变化。建立混合淋巴细胞反应体系,检测MSCs体外抑制T淋巴细胞增殖的能力,实验分为3组:阴性对照组为C57BL/6的T淋巴细胞,空白对照组的DCs刺激T淋巴细胞,实验干预组为MSCs于DCs共培养后刺激T淋巴细胞。
　　结果：小鼠乳鼠提取培养出的骨髓源性MSCs,体外可以大量增殖,细胞干性稳定;纯化后的第四代可以向成骨、成脂方向分化,并且MSCs经流式细胞术检测CD29、MHC-Ⅱ、CD105及CD34表分别为98.300％、0.898%、45.400%、0.849%,符合MSCs抗原表达。BM-MSCs与DCs的共培养,抑制了DCs表面MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86的表达,抑制DCs的发育成熟,这种阻碍作用不可被脂多糖(LPS)所逆转。MSCs对DCs诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用,空白对照组组CD4+T细胞和CD8+T细胞的分裂比例分别为30.8%和33.4%,MSCs干预组CD4+T和CD8+T细胞的分裂比例分别为5.36%和3.94%。
　　结论：随着供体年龄的增长,骨髓间充质干细胞的数量减少,增殖能力衰退;本实验探究出乳鼠提取培养BM-MSCs的方案,并且证实提取出的细胞在体外具有强烈的免疫抑制作用,应用MSCs可以抑制DCs的成熟,对T淋巴细胞的增殖亦有抑制作用,从而为诱导移植免疫耐受提供了一种新的途径。

目录

封面

声明

目录

全文主要缩略

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一．材料

二．mMSCs的分离及培养

三．流式细胞仪检测mMSCs表面标志

四．mMSCs诱导分化能力的鉴定：成骨和成脂细胞诱导

五．小鼠骨髓源性树突状细胞（BM-DCs）的分离和培养

六．流式细胞学鉴定BMDCs的表面标志

七．MSCs与DCs共培养

八．CFSE方法检测T淋巴细胞增殖

结果

一．BM-MSCs形态学观察

二．BM-MSCs表面标记的测定

三．BM-MSCs多向分化的能力鉴定

四．间充质干细胞（MSCs）增殖曲线

五．MSCs对LPS刺激的DCs表面分子表达的影响：

六．MSCs干预后的DCs抑制同种混合淋巴细胞反应

讨论

参考文献

综述

致谢