Tim-3表达对慢性乙肝患者外周血CD8+T细胞功能的影响

摘要

目的：1.明确慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T细胞Tim-3的表达及临床意义。
　　2.明确Tim-3表达对慢性乙型肝炎患者外周血总CD8+T细胞及HBV特异性CD8+T细胞功能的影响。
　　方法：1.实时荧光定量PCR技术测定血清HBVDNA水平。
　　2.时间分辨荧光免疫法测定HBV感染病毒标志物。
　　3.全自动生化分析仪检测肝功能ALT、TBIL等。
　　4.HBV特异性CD8+T细胞扩增：CHB患者外周血PBMCs分离，加入工作浓度为1mg/ml HBcAg18-27多肽1μl于48孔板各培养孔，37℃5％ CO2孵箱中孵育，第四天加入细胞因子IL-2维持细胞增殖10天。
　　5.流式细胞技术：a.检测CHB患者外周血PBMCs中HLA-A2阳性型别；b.检测CHB患者外周血PBMCs中CD8+T细胞Tim-3、CD57及IFN-γ表达；C.以Tim-3mAb阻断Tim-3/Tim-3L通路后，检测Core18-27Pentamer+CD8+T细胞增殖和细胞毒功能的改变。
　　6.酶联免疫吸附试验：以Tim-3mAb阻断Tim-3/Tim-3L通路后，ELISA检测培养上清细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的表达。
　　结果：1.CHB患者外周血CD8+T细胞Tim-3表达水平显著高于健康人(F=33.41，P<0.01)。进一步研究发现CHB患者外周Tim-3+CD8+T细胞CD57表达水平显著高于Tim-3-CD8+T细胞(P<0.05)，并且Tim-3表达水平与CD57水平呈正相关(r＝0.41，P<0.05)。
　　2.CHB患者外周血Tim-3+CD8+T细胞IFN-γ表达水平显著低于Tim-3-CD8+T细胞IFN-γ水平(P<0.01)，并且Tim-3表达与IFN-γ水平呈负相关(r=0.55，P<0.01)。
　　3.CHB患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组core18-27Pentamer+CD8+T细胞频数显著高于Tim-3mAb未阻断组(t=2.29，P<0.05)。
　　4.CHB患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组Pentamer+CD8+T细胞perforin和CD107a表达水平明显高于Tim-3mAb未阻断组(t=2.87，P<0.05)。
　　5.CHB患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2显著高于Tim-3mAb未阻断组(t值分别为2.62、2.30和2.61，P<0.05)。
　　结论：1.CHB患者外周血CD8+T细胞高表达Tim-3，与肝脏炎症水平成正相关。
　　2.CHB患者外周血表达Tim-3的CD8+T细胞表型老化，生成IFN-γ能力下降。
　　3.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，CHB患者PBMCs中Pentamer+CD8+T细胞数量增多。
　　4.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，能提高CHB患者PBMCs中Pentamer+CD8+T细胞CD107a和perforin表达水平。
　　5.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，CHB患者外周血PBMCs分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平明显增多。