油菜长链脂酰CoA合成酶基因的克隆与功能鉴定

摘要

在油料作物中，种子油脂是对人类最具有经济价值的生活必需品和工业原料，提高种子油脂含量也就是提升油料作物的生产效益。本文主要通过克隆长链酰基辅酶A合成酶基因并鉴定其在油脂合成途径中的生物学功能，从而期望通过基因工程手段提高油料作物种子含油量。
　　 长链酰基辅酶A合成酶(LACS)把游离脂肪酸活化成为长链酰基辅酶A，从而在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。这类重要的酶参与若干种与脂肪酸相关的代谢，如脂肪酸链的活化和延伸，磷脂、甘油三酯、茉莉酸的生物合成等。最近我们实验室从油菜油脂合成旺盛部位(花和发育期的种子)分离出四个长链脂酰辅酶A合成酶基因(BnLACS1、BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4)。生物信息学分析显示这四个长链脂酰辅酶A合成酶(BnLACSs)氨基酸序列都具有三个Block，初步被认为属于LACS家族。分子进化树分析显示，BnLACS1与拟南芥AtLACS1具有较高的同源性，BnLACS2和BnLACS3与拟南芥AtLACS2具有较高的同源性，AtLACS1和AtLACS2定位于内质网上，在植物角质主要成分长链脂肪酸的合成中起着重要作用。BnLACS4与定位于叶绿体的AtLACS9有较高的同源性。
　　 通过酵母LACS缺陷型补救实验，进一步证明四个BnLACSs都具有LACS活性。油菜BnLACSs蛋白都偏好利用长链脂肪酸。在水解蛋白酶缺陷型酵母pep4中异源表达，结果显示BnLACS1和BnLACS2能够使宿主酵母的脂肪酸和油脂含量显著提高。以上在酵母真核表达系统中的结果初步确定BnLACS1和BnLACS2参与油脂合成，并且能够使酵母油脂含量提高。
　　 利用RT-PCR技术分别分析了BnLACS1、BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4在不同含油量油菜品系种子(35DAP)中的表达差异，结果显示在高含油量品系中这些基因表达更为强烈。研究这四个基因在高含油量油菜(50％)和低含油量油菜(30％)两个油菜品系的种子发育时期的表达丰度动态变化，结果显示BnLACS1和BnLACS2表达量变化趋势与种子发育期油脂合成速率的S型曲线趋势一致，并且结果还进一步验证BnLACS1和BnLACS2表达量在高含油量油菜品系种子明显高于低含油量油菜品系种子。以上结果显示BnLACSs，尤其是BnLACS1和BnLACS2在油菜种子的油脂合成途径中起着重要作用。
　　 为了鉴定油菜BnLACSs的生物学功能，我们还构建了各个基因的双元植物表达载体，载体中利用在种子中特异表达的Napin启动子，然后通过农杆菌介导转化拟南芥和甘蓝型油菜。目前已经得到BnLACS1和BnLACS4的拟南芥转化株系，并通过筛选得到转基因纯系。通过浸花法和抗生素筛选法得到油菜转化株系，利用近红外和核磁共振技术初步分析显示：BnLACS1油菜转基因植株的种子含油量提高约5％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写与符号

声明

第一章绪论

1.1油菜油脂研究进展

1.1.1油脂含量的遗传基础

1.1.2油脂生物合成代谢途径及调控

1.1.3油菜转基因技术的进展

1.2长链脂酰CoA合成酶(LACS)

1.2.1长链脂酰CoA合成酶参与的反应

1.3本研究的目的和意义

1.4主要研究内容和技术路线

1.4.1主要研究内容

1.4.2技术路线

第二章油菜BnLACSs基因的克隆鉴定及生物信息学分析

2.1材料

2.1.1植物材料、菌种、载体

2.1.2酶和化学试剂

2.1.3基本溶液的配制

2.1.4主要仪器设备

2.1.5引物设计与合成

2.2方法

2.2.1植物总RNA的提取

2.2.2除去RNA中的基因组DNA

2.2.3反转录

2.2.4 PCR扩增

2.2.5连接反应

2.2.6大肠杆菌热击感受态的制备

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的热击转化

2.2.8 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA

2.2.9生物信息学分析

2.3结果与分析

2.3.1油菜BnLACSs基因的克隆

2.3.2油莱长链脂酰COA合成酶的生物信息学分析

2.4讨论与总结

第三章油菜BnLACSs的功能鉴定与表达分析

3.1材料和试剂

3.1.1材料和菌种

3.1.2主要试剂

3.1.3基本溶液及培养基

3.1.4喷显剂的配制

3.1.5酵母培养基

3.1.6引物设计

3.1.7主要仪器设备

3.2方法

3.2.1酵母表达载体的构建

3.2.2酵母感受态细胞的制备

3.2.3重组质粒高效转化酵母感受态细胞

3.2.4互补缺陷型酵母YB525

3.2.5酵母细胞的诱导表达以及外源基因的转录分析

3.2.5酵母的油脂含量及成分的检测

3.2.6酵母脂肪酸的气相分析

3.3结果与分析

3.3.1酵母表达载体的构建

3.3.2酵母LACS突变体的功能互补

3.3.3油菜BnLACSs底物偏好性分析

3.3.4油菜BnLACSs在酵母细胞pep4中正确转录表达

3.3.5油菜BnLACSs对酵母细胞油脂的影响

3.3.6酵母脂肪酸的气相分析

3.4总结与讨论

第四章油菜BnLACSs在不同含油量油菜品系种子内的表达模式分析

4.1材料和试剂

4.1.1材料和菌种

4.1.2主要试剂

4.1.3引物设计

4.2方法

4.2.1 RT-PCR

4.2.2荧光定量PCR(Real time PCR)

4.3结果与分析

4.3.1油菜BnLACSs在不同含油量种子中的表达分析

4.3.2油菜BnLACSs在高低含油量品系种子发育期中的表达分析

4.4讨论与小结

第五章油菜长链脂酰CoA合成酶基因植物表达载体的构建与转化

5.1材料和试剂

5.1.1植物材料、菌种和试剂

5.1.2基本缓冲液

5.1.3植物培养基

5.1.4引物设计与合成

5.2方法

5.2.1植物表达载体的构建

5.2.2农杆菌感受态细胞的制备

5.2.3冻融法转化农杆菌感受态细胞

5.2.4阳性克隆的鉴定和保存

5.2.5重组质粒pCAMBIA2200-Napin-BnLACS1和pCAMBIA2200-Napin-BnLACS2的油菜转化

5.2.6抗生素筛选转基因植株

5.2.7转基因植株的PCR检测

5.2.8重组质粒pCAMBIA2200-Napin-BnLACS1和pCAMBIA2200-Napin-BnLACS4的拟南芥转化

5.2.9抗性植株的筛选及纯系的获得

5.2.10转基因植株的PCR检测

5.2.11拟南芥种子脂肪酸含量的测定

5.3结果与分析

5.3.1油菜BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4的植物表达载体鉴定

5.3.2重组质粒转化农杆菌的鉴定

5.3.3转基因拟南芥的筛选和鉴定

5.3.4转基因油菜的筛选和鉴定

5.3.5转基因植株的表型分析

5.4讨论与小结

第六章总结与展望

6.1主要工作总结

6.2工作展望

参考文献(References)

致 谢

在学期间发表论文、专利及参加课题