安氏隐孢子虫体外发育形态观察及其调控宿主细胞凋亡机制初步研究

摘要

目的：隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)是一种主要寄生于胃肠道上皮细胞内的原虫,是引起人类腹泻的重要病原体之一。安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)是近年来新发现的一种可感染人类的隐孢子虫,作为一种潜在的病原,它不仅与微小隐孢子虫寄生部位不同,而且在同样的条件下生长和增殖的速度也较微小隐孢子虫快。因而,开展安氏隐孢子虫生长发育及其调控细胞凋亡机制的研究对隐孢子虫病治疗具有重要意义。本研究通过Giemsa染色法和real—time PCR技术检测安氏隐孢子虫在人结肠腺癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞和人胃腺癌(human stomach adenocarcinoma,AGS)细胞中的增殖效果,以建立安氏隐孢子虫适宜的宿主；通过Giemsa染色法、HE染色法和改良抗酸染色法观察安氏隐孢子虫在细胞中的生长发育,并比较三种染色技术对虫体不同发育时期的鉴别效果,为隐孢子虫生长发育的研究提供一种简便、易行的方法；通过Hoechst33258染色法和Annexin V-FITC／PI双染,观察安氏隐孢子虫对宿主细胞形态及细胞凋亡率的影响；建立半定量RT-PCR技术测定安氏隐孢子虫感染不同时间Caspase3和Bcl-2基因的表达水平,初步研究安氏隐孢子虫对宿主细胞凋亡的调控机制。
　　 方法：取培养至对数生长期的HCT-8细胞和AGS细胞,接种于6孔培养板中,待细胞生长融合至60％～70％时,加入2.5×105个安氏隐孢子虫卵囊,培养至24 h和48 h,以Giemsa染色法和real-time PCR技术检测虫体在细胞中的增殖；取培养至对数生长期的HCT-8细胞,接种于6孔培养板中,待细胞生长融合至60％～70％时,加入2.5×105个安氏隐孢子虫卵囊,培养至5 h、24 h、48 h、72 h和96 h,经Giemsa、HE和改良抗酸染色观察虫体的生长发育形态。安氏隐孢子虫卵囊感染HCT-8细胞后,经Hoechst33258染色法检测凋亡细胞；经Annexin V-FITC／PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率；半定量RT-PCR技术测定感染后5 h、12 h、24 h、48 h和72 h,Caspase3和Bcl-2基因的表达水平。
　　 结果：经Giemsa染色检测感染24 h,HCT-8和AGS细胞中虫体数量分别为97.670±5.686和85.670±3.786；培养至48 h,HCT-8和AGS细胞中虫体数量分别为144.000±19.975和95.333±20.526。Real—time PCR法测得24 h HCT-8和AGS细胞中卵囊COWP基因拷贝数分别为469.000±107.531和275.333±40.054；48 h HCT-8和AGS细胞中卵囊COWP基因拷贝数分别为664.000±112.708和360.333±67.144。安氏隐孢子虫卵囊感染HCT-8细胞后,经改良抗酸染色后可清楚地观察到子孢子、滋养体、裂殖体、雌配子体、雄配子体、合子和卵囊,而经Giemsa和HE染色后仅隐约鉴别出子孢子、滋养体、雌配子体、合子和卵囊,未观察到裂殖体和雄配子体。安氏隐孢子虫卵囊感染HCT-8细胞24 h和48 h,经Hoechst33258染色法可观察到凋亡细胞；经Annexin V-FITC／PI双染流式细胞仪分析感染24 h,对照组与感染组细胞凋亡率分别为7.41±0.56％和8.36±0.33％；感染48 h,感染组绌胞凋亡率为12.85±0.24％、对照组为10.76±0.36％；经半定量RT-PCR技术测得安氏隐孢子虫感染5,12,48和72 h Caspase3mRNA表达量明显增加；而Bcl-2 mRNA的表达量未见明显差异。
　　 结论：与AGS细胞相比,以HCT-8细胞作为体外感染模型更利于安氏隐孢子虫的增殖。改良抗酸染色法较Giemsa和HE染色法更省时、效果更佳,此法易于分辨细胞和虫体,并可清晰辨别虫体发育的不同阶段。安氏隐孢子虫感染可致细胞凋亡,Caspase3基因参与了安氏隐孢子虫介导的细胞凋亡,但Bcl-2抗细胞凋亡作用不明显。

目录

文摘

英文文摘

图表清单

主要英文缩写与名词对照

第一章 引言

1.1 动物模型在隐孢子虫研究中的应用

1.1.1 动物模型的建立方法

1.1.2 动物模型的用途

1.2 细胞模型在隐孢子虫研究中的应用

1.2.1 细胞模型的建立方法

1.2.2 细胞模型的用途

1.3 隐孢子虫调控宿主细胞凋亡的研究

1.3.1 隐孢子虫调控宿主细胞凋亡的意义

1.3.2 隐孢子虫调控宿主细胞凋亡的机制

1.4 本研究的立题意义

第二章 安氏隐孢子虫在HCT-8和AGS细胞中增殖效果的研究

2.1 实验仪器和材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验耗材

2.1.3 实验试剂

2.1.4 试剂配制

2.1.5 实验虫种

2.1.6 实验细胞

2.2 实验方法

2.2.1 安氏隐孢子虫卵囊提纯

2.2.2 安氏隐孢子虫卵囊活率检测

2.2.3 安氏隐孢子虫卵囊无菌化处理及脱囊

2.2.4 Giemsa染色法观察细胞中安氏隐孢子虫的增殖

2.2.5 Real-time PCR测定安氏隐孢子虫卵囊COWP基因拷贝数

2.2.6 统计学分析

2.3 结果

2.3.1 光学显微镜观察细胞中安氏隐孢子虫的增殖

2.3.2 Real-time PCR测定HCT-8和AGS细胞中安氏隐孢子虫卵囊COWP基因拷贝数

2.4 讨论

第三章 比较不同染色方法观察安氏隐孢子虫在HCT-8细胞中的生长发育

3.1 实验仪器和材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验耗材

3.1.3 实验试剂

3.1.4 试剂配制

3.1.5 实验虫种

3.1.6 实验细胞

3.2 实验方法

3.2.1 安氏隐孢子虫卵囊无菌化处理及脱囊

3.2.2 安氏隐孢子虫细胞培养及生长发育的观察

3.3 结果

3.3.1 安氏隐孢子虫在HCT-8细胞内的生长发育过程

3.3.2 培养上清中观察安氏隐孢子虫发育阶段

3.3.2 分析3种染色方法的染色效果

3.4 讨论

第四章 安氏隐孢子虫调控HCT-8细胞凋亡的研究

4.1 实验仪器和材料

4.1.1 实验仪器

4.1.2 实验耗材

4.1.3 实验试剂

4.1.4 试剂配制

4.1.5 实验虫种

4.1.6 实验细胞

4.2 实验方法

4.2.1 安氏隐孢子虫卵囊无菌化处理及脱囊

4.2.2 Hoechst 33258观察HCT-8细胞凋亡

4.2.3 细胞凋亡的DNA电泳检测

4.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

4.2.5 半定量RT-PCR检测细胞凋亡相关基因的表达

4.2.6 统计学分析

4.3 结果

4.3.1 Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡细胞形态学变化

4.3.2 细胞凋亡的DNA电泳分析

4.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

4.3.4 半定量RT-PCR检测结果

4.4.讨论

结论与展望

参考文献

致谢

读硕期间发表论文、参加课题