一种试剂盒以及安氏隐孢子虫的检测方法

摘要

本发明提供的试剂盒，包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和安氏隐孢子虫阳性模板，所述的LAMP引物包括外引物、内引物及环引物。安氏隐孢子虫的检测方法，其检测步骤包括LAMP引物的设计与合成；LAMP反应体系的建立；LAMP扩增，判断样品中菌种的种类。本发明提供的试剂盒及检测方法，按建立的体系加样即可实时检测安氏隐孢子虫，方便基层快速、准确简便的检测安氏隐孢子虫。

说明书

 

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种安氏隐孢子虫的检测方法以及该方法所采用的试剂盒。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium Tyzzer)是一种危害严重的机会性致病人兽共患胃肠道原虫，卵囊污染水源、食物等造成隐孢子虫病暴发流行，宿主广泛，可感染包括人在内的多种动物。在绝大部分地面水、受地面水污染的浅井和防护条件较差的深井水、处理不良的自来水、处理或未处理过的排放污水、经过滤的游泳池水中，均可检出隐孢子虫卵囊（沈玉娟等，2005）。安氏隐孢子虫(Cryptosopridium andersoni)主要感染断奶犊牛、育成牛和成年牛（Paul等，2009），感染奶牛后可引起奶牛产奶量下降，体质变弱，是影响奶牛业发展的重要致病因素之一（任文陟等，2010）。

传统检测方法如粪便浓集、改良抗酸染色和免疫荧光染色法等检测卵囊步骤繁琐，敏感性低，许多干扰因素如酵母、饲料颗粒以及肠道内容物等均影响检测效果（陈甫等，2006）。而目前使用最普遍的分子生物学检测隐孢子虫方法为Xiao等建立的Nest-PCR -RFLP（Xiao等，1999），特点是通用性好，可检测目前发现的所有隐孢子虫种类，但需要两轮PCR以及酶切鉴定的过程方能定种，耗时较长。鉴于安氏隐孢子虫的危害性，急需建立一种快速检测方法。

Notomi等在2000年报道了一种新的DNA扩增技术-环介导等温扩增（简称LAMP）技术，该技术具有方法简单、快速、特异性强的特点，而且不需要PCR仪，肉眼可判断结果及反应时间短等优点。该技术中所用到的LAMP方法检测需1小时后加入染料才能判断结果，反应中加入的荧光染料syber-green，需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染，缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定，这已成为限制LAMP技术进一步发展的一大难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测安氏隐孢子虫的方法，公开一种安氏隐孢子虫的检测方法以及该方法所采用的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和预先处理的安氏隐孢子虫阳性模板；所述的LAMP引物包括外引物、内引物及环引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的内引物是FIP和BIP；

所述的环引物是LF和LB；

其中引物的序列分别为：

F3   CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3  CATACATTGCTGCCCAGA

FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各组分的份量为：

F3                       100μl

B3                       100μl

FIP                      100μl

BIP                      100μl

LF                       100μl

LB                       100μl

2×反应缓冲液             12.5μl

Bst DNA聚合酶            60μl

荧光目视检测试剂          0.1ml

超纯水                    1ml

安氏隐孢子虫阳性模板      100μl；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs；2×反应缓冲液具体配制方法是将PH值为8.8的Tris-HCL 40mM、KCL 20mM、MgSO₄ 16mM、(NH₄)₂SO₄ 20mM、Tween20 0.2℅ 、Betaine 1.6M 和dNTPs 2.8 mM混合均匀。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的安氏隐孢子虫阳性模板预先处理步骤是取待检牛的新鲜粪便20.0~50.0g，置灭菌烧杯充分搅匀，称取搅拌后的粪便样本180~220mg于2ml离心管中，反复冻融3~5次，按粪便基因组DNA提取说明书提取。

本发明提供的安氏隐孢子虫的检测方法，含有以上所述的试剂盒，具体检测步骤如下：

1）LAMP引物的设计与合成；

2）LAMP反应体系的建立；        

3）LAMP扩增，判断样品中菌种的种类。

以上所述的LAMP反应体系以25μl计：

2×反应缓冲液                         12.5μl

F3                                   5pmol

B3                                   5pmol

FIP                                  40pmol

BIP                                  40pmol

LF                                   20pmol

LB                                   20pmol

安氏隐孢子虫阳性模板                  2μl

超纯水                                补足25μl。

以上所述的判断样品菌株的方法采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测。

本发明的实质性特点和进步是：

1）  特异性强

使用本发明所设计的LAMP引物，结合本发明引物的试剂盒检测安氏隐孢子虫的特异性，检测结果表明所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。

2）              灵敏度高

用天根粪便基因组DNA试剂盒分别提取DNA后，结合本发明LAMP引物，进行环介导等温扩增，得到细菌纯培养物检测限为2~3卵囊/克粪，而普通PCR法细菌纯培养物检测限一般为10卵囊/克粪，灵敏性比PCR方法得到明显提高。

3）迅速得出结果

普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，现在普遍应用的LAMP方法也要在1小时左右得出结果，本发明提供的试剂盒所用的检测方法，其反应在20-35min间出现扩增，便可获得LAMP反应结果，反应迅速，结果可靠。

4）  不造成污染

现有LAMP方法检测荧光可视化检测，用于观察的荧光染料为反应后加入，加入的商用染料（非syber-green），该方法存在开盖跑气溶胶，污染实验室的危险；本发明使用的荧光染料为钙黄绿素，荧光染料在反应前加入，检测过程不需要开盖，避免污染实验室。

附图说明

图1是本发明LAMP检测方法的特异性检测结果；2株安氏隐孢子虫反应管出现浊度的上升曲线，5株阴性对照菌反应管无扩增情况。

图2是本发明LAMP检测方法的敏感性检测结果；LAMP 法细菌纯培养物均出现浊度的上升现象，检测限为2卵囊/克粪。

图3是本发明LAMP检测方法的荧光可视化检测结果，加入荧光染料后肉眼观察结果；右管为以安氏隐孢子虫为模板的反应情况，出现亮绿色的荧光；左管为阴性对照。

具体实施方式

本发明以安氏隐孢子虫的COWP基因作为检测目标，COWP基因序列设计合成引物。COWP基因是安氏隐孢子虫的卵囊壁基因序列，为在种属间的变异率低的保守序列，因而可以作为通用性基因来监测安氏隐孢子虫。本发明所用的试剂盒包，括LAMP引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和安氏隐孢子虫阳性模板。

所述的LAMP引物包括外引物、内引物及环引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的内引物是FIP和BIP；

所述的环引物是LF和LB；

其中引物的序列分别为：

F3   CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3  CATACATTGCTGCCCAGA

FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各组分的份量为：

F3                       100μl

B3                       100μl

FIP                      100μl

BIP                      100μl

LF                       100μl

LB                       100μl

2×反应缓冲液             12.5μl

Bst DNA聚合酶            60μl

荧光目视检测试剂          0.1ml

超纯水                    1ml

安氏隐孢子虫阳性模板      100μl；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs；2×反应缓冲液具体配制方法是将PH值为8.8的Tris-HCL 40mM、KCL 20mM、MgSO₄ 16mM、(NH₄)₂SO₄ 20mM、Tween20 0.2℅ 、Betaine 1.6M 和dNTPs 2.8 mM混合均匀。

运用本发明试剂盒，具体检测安氏隐孢子虫的步骤如下：

1、材料的准备

安氏隐孢子虫、球虫由广西壮族自治区兽医研究所实验室分离鉴定；牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫为广西大学寄生虫研究室李健老师惠赠。LAMP法DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司。

2、LAMP 引物的设计与合成

根据GenBank 中的安氏隐孢子虫的COWP基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套LAMP引物，其中F3/B3 为外引物，FIP/BIP 为内引物，LF/LB为环引物； 

F3   CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3  CATACATTGCTGCCCAGA

FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG。

3、阳极模板前处理

取待检牛的新鲜粪便20.0~50.0g，置灭菌烧杯充分搅匀，称取搅拌后的粪便样本180~220mg于2ml离心管中，反复冻融3~5次，按粪便基因组DNA提取说明书提取，提取的是安氏隐孢子虫模板为阳极模板。

4、LAMP 反应体系建立

按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：

2×反应缓冲液                         12.5μl

F3                                   5pmol

B3                                   5pmol

FIP                                  40pmol

BIP                                  40pmol

LF                                   20pmol

LB                                   20pmol

安氏隐孢子虫阳性模板                  2μl

超纯水                                补足25μl

LAMP 反应在实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，反应温度以试剂盒推荐的63℃做为反应温度。

5、LAMP检测方法

1）特异性检测

分别提取2株安氏隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫和球虫DNA，进行LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性，实时监测试验进程进行结果判定。

2）敏感性检测

测定敏感度时，将经过计数的隐孢子虫卵囊加入牛粪中，浓度分别为2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹、0个卵囊/g粪，用天根粪便基因组DNA试剂盒分别提取DNA后，进行扩增。

3）荧光可视化检测

根据实时浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应25分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。

实施例1  LAMP检测方法的特异性结果

对2株安氏隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫和球虫DNA应用试剂盒进行LAMP扩增，结果如图1 所示，2株安氏隐孢子虫反应管在25分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，5株阴性对照反应管曲线均无扩增情况出现，LAMP呈阴性结果。

实施例2  LAMP检测方法的敏感性结果

将经过计数的隐孢子虫卵囊加入牛粪中，浓度分别为2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹、0个卵囊/g粪，结合试剂盒进行LAMP扩增，结果如图2所示，从图中看出，LAMP法细菌纯培养物检测限约为2卵囊/g粪，而PCR 法细菌纯培养物检测限一般为10卵囊/g粪数量级。

实施例3  LAMP检测方法的荧光可视化检测结果

根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63℃反应30分钟后，在紫外灯下观察，图3为观察结果，右管为以安氏隐孢子虫为模板的反应情况，左管为阴性对照，表明建立的方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃30分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。