一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞实验研究

摘要

目的:探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性。
　　方法:收集ICR小鼠骨髓EPCs，Ficoll分离单核细胞，使用含有血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5、10、15及20d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL细胞悬液按0.6mL/孔重新铺6孔板，待细胞生长至80％左右融合时，用脂质体LipofectamineTM2000体外转染eNOS基因至EPC。转染48h后，采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达，硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量，荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量。
　　结果:培养5d后细胞开始出现上皮细胞的形态，有伪足出现;培养10d，细胞开始增殖，成圆形，出现梭形细胞;培养15d，细胞出现较为典型的内皮细胞形态，铺路石状;培养20 d，细胞出现长梭形拉网状，即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示，CD34在EPCs中的表达水平随培养时间延长有渐变减弱的趋势;VEGFR-2在EPCs的表达水平随培养时间延长有渐变增强的趋势。成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体。转染48 h后，EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01)，NO含量明显升高(P＜0.01)，ROS含量明显降低。
　　结论:骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞，取材方便，扩增能力较强。脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC，并能在EPC中有效表达。

目录

声明

摘要

英文缩写索引

引言

一、材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 主要试剂

1．1．2 常用液体配制

1．1．3 主要实验仪器

1．2 方法

二、结果

三、讨论

参考文献

综述 内皮祖细胞作用机制及移植应用

攻读硕士学位期间发表文章情况

致谢