Angptl2对主动脉血管平滑肌细胞钙化的影响

摘要

目的:
　　炎症因子可促进动脉粥样硬化的发生发展及动脉粥样硬化钙化的生成，而平滑肌细胞在动脉粥样硬化钙化中起到很关键的作用，血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)作为一种炎症因子具有很强的致动脉粥样硬化作用，其是否对血管钙化产生影响尚未有研究报道，本研究旨在观察血管生成素样蛋白2对主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的影响。
　　方法:
　　本实验采用A7r5细胞株作为钙化模型制作细胞，用含10mmol/Lβ甘油磷酸盐(β-GP)培养液培育9d建立体外细胞钙化模型，冯库萨染色法鉴定细胞钙化;首先用重组ANGPTL2浓度梯度干预后，Western blot方法检测Runx2蛋白表达水平，冯库萨染色法鉴定各组细胞的钙化程度，钙离子检测试剂盒检测各组细胞钙离子含量并测量蛋白标化，碱性磷酸酶检测试剂盒检测各组细胞间碱性磷酸酶活性并测量蛋白标化。重组ANGPTL2时间梯干预后，Western blot方法检测Runx2蛋白表达水平，钙离子检测试剂盒检测各组细胞钙离子含量并测量蛋白标化，碱性磷酸酶检测试剂盒检测各组细胞间碱性磷酸酶活性并测量蛋白标化。最后重组ANGPTL2干预及抗ANGPTL2中和抗体阻断其生物学活性，每次首先加入重组ANGPTL2孵育30min后，用PBS清洗两边后加入抗ANGPTL2中和抗体，每3d换液一次，孵育9d后，共聚焦显微镜观察各组细胞间钙化程度的形念学差异，钙离子检测试剂盒检测各组细胞钙离子含量并测量蛋白标化，碱性磷酸酶检测试剂盒检测各组细胞间碱性磷酸酶活性并测量蛋白标化。CCK8检测ANGPTL2对血管平滑肌细胞增殖的影响。
　　结果:
　　(1)β甘油磷酸盐(β-GP)诱导9d后成功建立血管平滑肌细胞钙化模型。
　　(2) ANPTL2对细胞钙化的影响呈现出一定的浓度依赖性，在10ng/ml浓度细胞钙化及钙离子沉积量、碱性磷酸酶活性、Runx2蛋白的表达量达到最强生物学效应，ANGPTL2干预血管平滑肌细胞后，Runx2蛋白表达显著增高，并且呈现出时间依赖性，蛋白表达在第9d增加最为明显，同样的细胞钙碱性磷酸酶活性也在第9d达到峰。
　　(3)冯库萨染色结果显示经ANGPTL2干预9d后血管平滑肌细胞钙化程度较同型对照组显著增加，而阻断ANGPTL2生物学活性后细胞钙化程度较干预组显著降低，ANGPTL2可促进血管平滑肌细胞钙离子的沉积量增加，碱性磷酸酶的活性及钙化生物学标记物Runx2的蛋白表达量均较同型对照组显著增加，经抗ANGPTL2中和抗体阻断后细胞钙离子沉积量、碱性磷酸酶活性、Runx2蛋白的表达量均显著降低。
　　(4) ANGPTL2干预72h后血管平滑肌细胞增殖率较对照组显著下降，而同型对照IgG干预后血管平滑肌细胞增殖率与对照组无明显差异。
　　结论:
　　血管生成素样蛋白2可显著促进主动脉血管平滑肌细胞钙化。

目录

声明

摘要

常用缩略词对照表

第一章 绪论

1．1 ANGPTL2与动脉粥样硬化

1．2 炎症、动脉粥样硬化及血管钙化之间的相互关系

1．3 展望

第二章 ANGTL2对血管平滑肌细胞钙化的影响

2．1 材料

2．1．1 主要器械

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 主要溶液及成份

2．1．4 实验细胞

2．2 实验方法

2．2．1 细胞株的培养及传代

2．2．2 钙化模型的制作

2．2．3 冯库萨染色

2．2．4 ANGPTL2干预后对血管平滑肌细胞钙化的影响

2．2．5 细胞蛋白的提取及Western蛋白印迹

2．2．6 钙离子含量检测

2．2．7 碱性磷酸酶活性检测

2．2．8 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 细胞钙化模型

2．3．2 ANGPTL2浓度对主动脉血管平滑肌细胞钙化的影响

2．3．3 ANGPTL2对主动脉血管平滑肌细胞钙化影响具有时效性

2．3．4 ANGPTL2对主动脉血管平滑肌细胞钙化的影响

2．3．5 ANGPTL2对主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

2．4 讨论

第三章 结论

参考文献

文献综述1 Angptl2的生理及病理生理作用研究进展

文献综述2 血管钙化的分子生物学和病理生理学机制

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文