AGEs诱导自噬促进人主动脉血管平滑肌细胞钙化

摘要

目的：探讨细胞自噬在晚期糖基化终末产物（advance glycation end products，AGEs）诱导的人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells，HAVSMCs）钙化中的作用机制。　　方法：在此项研究中，选用第5-8代人主动脉血管平滑肌细胞进行实验。将人主动脉血管平滑肌细胞分为对照组及钙化组，钙化组使用40mg/L AGEs诱导4天。使用Western Blot检测两组细胞中OPG、OPN、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平。按AGEs干预细胞的时间不同将实验分组为A1组（40mg/L AGEs干预1天）、A2组（40mg/L AGEs干预2天）、A3组（40mg/L AGEs干预3天）、A4组（40mg/L AGEs干预4天），分别使用Western Blot检测各组细胞中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平，再使用免疫荧光法检测各组细胞内LC3表达差异。ELISA法检测各组细胞内ALP活性。然后，将实验分为对照组、自噬抑制组及钙化组，自噬抑制组使用1μmol/L渥曼青霉素（Wortmannin）+40mg/L AGEs干预4天，钙化组仍以40mg/L AGEs干预4天。Western Blot检测各组细胞中OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白的表达水平。ELISA法检测各组细胞内ALP活性。冯-库萨染色法检测细胞钙化程度。为探索相关信号通路与自噬的关系，使用Western Blot法分别对照组与AGEs组中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白的表达水平进行检测。　　结果：1.钙化组OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平相较对照组明显增高（P<0.05）。2.A1组、A2组、A3组、A4组中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白水平依次升高（P<0.05），ALP活性也依次升高（P<0.05）。各组细胞内LC3II荧光斑点也随干预时间增加而增加。3.自噬抑制组的OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白表达水平相较于钙化组降低，而相较于对照组增高（P<0.05）。ALP活性及冯-库萨染色检测的细胞钙化程度也呈此趋势。4.相较于对照，AGEs组的PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平增高（P<0.05）。　　结论：1.AGEs诱导人主动脉血管平滑肌细胞钙化与自噬，且呈时间依耐性。2.自噬促进AGEs诱导人主动脉血管平滑肌细胞钙化。3.AGEs可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进自噬从而促进人主动脉血管平滑肌细胞钙化。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验细胞

1.2 实验相关试剂及制备方法

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4.1 人主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定

4.2 HAVSMCs胞内ALP含量检测

4.3 冯-库萨染色

4.4 细胞免疫荧光

4.5 蛋白印迹法 (Western Blot)

4.5 统计学处理

结果

1 HAVSMCs的培养与鉴定

2 AGEs对HAVSMCs钙化的影响

3 AGEs对HAVSMCs自噬的影响

4 AGEs干预不同时间对HAVSMCs自噬、钙化的影响

5 自噬对AGEs诱导的HAVSMCs钙化的影响

6 自噬相关通路在AGEs诱导的HAVSMCs钙化中的作用

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:细胞自噬在血管疾病中的研究进展

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