几种典型污染物的微萃取分析方法及其斑马鱼胚胎的毒性

摘要

近年来，环境水体中一些典型化学物质如环境内分泌干扰物(endocrinedisrupting compounds，EDCs)和三苯甲烷类生物染色剂(Triphenylmethane biologicalstain，TPM biological stain)等被广泛检出，其检出浓度为ppt-ppb级。这些有机污染物的低剂量、持续暴露可严重危害水生系统，且可通过生物富集和食物链的传递，最终造成对高等动物和人类的危害。因此，建立简单有效的分析方法，调查环境水体中此类污染物的现状及分布特征，研究其在接近真实浓度下的水生毒性，评估其生态风险，具有重要的理论和实际意义。 目前，普遍采用的固相萃取-液相色谱串联质谱(SPE-LC-MS/MS)方法虽然定量准确，但SPE前处理技术存在富集效率低、前处理复杂、检测所需样品量大（通常＞500 mL）、有机溶剂用量多等不足。与此相比，基于离子液体的中空纤维液膜微萃取技术（Hollow-fiber liquid-phase micro-extraction，HF-LPME），集采样、萃取、富集于一体，具有操作便捷、经济、高效、所需萃取剂和样品量少及环境友好等优点，已成为分析工作者研究的热门前处理技术。论文以HF-LPME作为环境水样中痕量污染物的富集手段，针对水体中几种典型污染物，构建两相或三相液相微萃取方法，实现对目标物的分离和高效富集;基于以上分析方法，对长江下游镇江段环境水样中的典型污染物EDCs和TPM进行分析，研究其分布特征，明确其残留水平;同时初步考察此类典型污染物在接近真实浓度下的水生生态风险，选择双酚A(BPA)和己烯雌酚(DES)作为典型目标物，研究其单独及联合暴露对斑马鱼（zebrafish，Daniorerio）胚胎先天免疫、抗氧化及发育相关基因表达的影响，为水体中此类污染物的生态风险评估提供科学依据。 主要研究内容和结论如下: 1.建立了一种针对环境水体中痕量4-n-壬基酚（4-n-NP）的液相微萃取方法。以中空纤维支载[C8MIM][PF6]液液微萃取为富集净化手段，并以HPLC/UV进行测定。在最优条件下（[C8MIM][PF6]5μL、pH5.0、盐浓度5％、萃取时间8h）所建方法对环境水体中4-n-NP的富集倍数可达1129倍，方法的检出限为0.05μg/L(S/N=3)，线性范围0.15～100μg/L，回收率为80.1％～105.6％。相对传统的富集方法，本法具有便捷、高效及环境友好的优势，可广泛应用于环境水体中此类污染物的分析测定。 2.建立了一种可同时测定环境水体中内分泌干扰物BPA、17-β-雌二醇(E2)、雌酮(E1)和DES的两相液液微萃取(HF-LPME)新方法，并以此对镇江市的内江地表水进行了相关污染调查。在最佳萃取条件([C8MIM][PF6]2.5μL、pH2.0、离子强度2.57 mol/L、萃取时间8h)下，该方法线性范围为0.15-100μg/L，且具有较高的富集倍数、较低的检出限、良好的重现性和较高的准确性。对内江沿线15个采样点的水样进行分析，结果发现其中6个点有BPA检出，浓度为0.25-0.92μg/L;2个点有DES检出(1.10-1.42μg/L);1个点有E2检出，浓度为1.79μg/L;E1无检出。所有检出点均分布于城市郊区附近，此处为污水排放地，表明城市污水排放是地表水体中内分泌干扰物污染的重要来源。 3.为提高萃取效率，减少平衡时间，以[C8MIM][PF6]为支载相，碱性水溶液为受体相，建立了三相中空纤维液液液微萃取方法，用以分析环境水样中痕量BPA和DES。在最适条件下，该方法对BPA和DES的富集倍数分别可达850和624;线性范围0.30-100μg/L;检出限分别为0.20和0.05μg/L(S/N=3)，重现性良好。另外，环境水体中广泛存在的腐殖质对测定结果无显著影响。运用该方法分析实际水样获得了满意的回收率(75.4-99.2％)。所建立方法操作简单且环境友好，适用于环境水体中痕量BPA和DES的富集检测。 4.在前期基础上，建立了中空纤维支载加入1％三辛基氧化膦(TOPO)的[BMIM][PF6]三相液膜微萃取富集方法，对环境水体中痕量孔雀石绿(MG)进行分析，获得了最佳的萃取条件。在该条件下，对水体中MG的富集倍数可达212倍，检出限为0.01μg/L(S/N=3)，线性范围0.20-100μg/L，加标回收率较高(84.0％-106.2％)。与传统萃取方法相比该方法具有操作快捷、高效、灵敏、环境友好的优势。以该方法对长江下游镇江段及部分池塘水进行检测分析，结果发现4个采样点的水样中检出MG（共15处采样点），浓度分别为1.73-11.06μg/L。 5.基于以上分析结果，研究长江中下游镇江段水体中的典型污染物BPA与DES单独及联合暴露对斑马鱼胚胎免疫及抗氧化相关基因表达的影响。结果表明，BPA与DES单独及联合对斑马鱼胚胎暴露72 h后，可影响其与免疫相关的基因IFNγ、IL-1β、Mx、CXCL-clc、Lyz、C3B、Cp和MPx的表达。与空白对照组相比，暴露于BPA+DES低剂量组可显著上调IFNγ和Mx的表达;暴露于DES低剂量组、BPA和BPA+DES高剂量组可显著下调MPx的表达，而暴露于BPA+DES高剂量组可显著上调Cp的表达。此外，BPA与DES单独及联合暴露下抗氧化相关基因的表达也受到了影响，如BPA可下调Mn-SOD和GPx的基因表达，而DES及其与BPA联合则可上调Mn-SOD、Cu/Zn-SOD及GPx的表达。析因分析表明，二者联合暴露对C3B的表达表现为协同作用。 6.BPA与DES单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育相关基因表达影响的研究。结果表明，BPA与DES单独及联合对斑马鱼胚胎暴露72 h后，可对斑马鱼胚胎发育相关基因表达产生显著影响。与空白对照组相比，mstn1、mstn2、vegf1、mt、wnt8a及hsp70基因的表达显著上调。析因分析表明，二者联合暴露对mstn2、vegf1、mt基因的表达表现出协同作用。说明DES与BPA联合暴露对斑马鱼胚胎的生长发育会造成一定程度的损伤。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 液相微萃取技术

1．1．1 单滴液相微萃取(SD-LPME)

1．1．2 分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)

1．1．3 冷诱导聚集液相微萃取(Cold-induced aggregationm icroextraction，CIAME)

1．1．4 超声辅助乳化微萃取(Ultrasound-assisted Emulsification Microextraction，USAEM[E)

1．1．5 中空纤维液相微萃取(hollow-fiber liquid-phase micro-extraction，HF-LPME)

1．1．6 两相和三相液相微萃取

1．1．7 静态、动态和连续流动液相微萃取

1．1．8 中空纤维膜液相微萃取

1．2 离子液体的性质及其在液相微萃取中的应用

1．2．1 离子液体的性质

1．2．2 离子液体在液相微萃取中的应用

1．3 环境类雌激素概述

1．3．1 环境类雌激素的理化性质及应用状况

1．3．2 环境水体中环境类雌激素的检测及污染现状

1．3．3 典型EDCs的潜在危害

1．4 孔雀石绿概述

1．4．1 孔雀石绿的理化性质

1．4．2 孔雀石绿的监测方法

1．5 本课题的目的、意义及研究内容

1．5．1 选题的目的和意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

第2章 中空纤维液膜微萃取分析环境水体中4-n-壬基酚

2．1 实验方法

2．1．1 仪器

2．1．2 材料与试剂

2．1．3 样品采集

2．1．4 色谱条件

2．1．5 萃取程序

2．2 结果与讨论

2．2．1 供体相pH值的影响

2．2．2 供体相离子强度的影响

2．2．3 萃取溶剂体积的影响

2．2．4 萃取时间的影响

2．2．5 方法的富集倍数

2．2．6 方法的线性范围与检出限

2．2．7 实际水样的检测

2．3 本章小结

第3章 中空纤维支载离子液体液相微萃取分析环境水体中双酚A，17-β-雌二醇，雌酮和己烯雌酚

3．1 实验方法

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂和材料

3．1．3 高效液相色谱分析条件

3．1．4 萃取程序

3．1．5 样品采集

3．2 结果和讨论

3．2．1 供体相pH值对萃取效率的影响

3．2．2 萃取剂体积对萃取效率的影响

3．2．3 离子强度对萃取效率的影响

3．2．4 萃取时间对萃取效率的影响

3．2．5 腐植酸对萃取效率的影响

3．2．6 方法评价

3．2．7 检测内江流域EDCs的污染

3．3 本章小结

第4章 中空纤维支载离子液体三相微萃取法检测环境水体中双酚A与己烯雌酚

4．1 实验方法

4．1．1 仪器

4．1．2 材料与试剂

4．1．3 高效液相色谱分析条件

4．1．4 萃取程序

4．2 结果和讨论

4．2．1 供体相和接收相pH值的影响

4．2．2 供体相离子强度的影响

4．2．3 接收相体积的影响

4．2．4 萃取时间的影响

4．2．5 腐植酸的影响

4．2．6 方法评价

4．2．7 实际应用

4．3 本章小结

第5章 中空纤维支载离子液体三相微萃取法检测环境水体中孔雀石绿

5．1 实验部分

5．1．1 仪器

5．1．2 材料与试剂

5．1．3 萃取程序

5．1．4 色谱分析条件

5．2 结果与讨论

5．2．1 供体相、接收相pH的影响

5．2．2 TOPO在支载相中浓度的影响

5．2．3 接收相体积的影响

5．2．4 供体相离子强度的影响

5．2．5 萃取时间的影响

5．2．6 腐植酸的影响

5．2．7 方法评价

5．2．8 实际水样的检测

5．3 本章小结

第6章 双酚A与己烯雌酚联合暴露对斑马鱼免疫相关基因表达的影响

6．1 仪器、材料与试剂

6．1．1 仪器

6．1．2 材料与试剂

6．2 实验方法

6．2．1 实验设计

6．2．2 实时定量分析

6．2．3 统计分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 BPA和DES单独及联合暴露对先天免疫相关基因表达的影晌

6．3．2 BPA和DES单独及联合暴露对抗氧化相关基因表达的影响

6．3．3 主成分分析

6．4 本章小结

第7章 双酚A与己烯雌酚对斑马鱼胚胎发育相关基因表达的影响

7．1 仪器、材料与试剂

7．1．1 仪器

7．1．2 材料与试剂

7．2 实验与结果

7．2．1 实验设计

7．2．2 实时定量分析

7．2．3 统计分析

7．3 结果与讨论

7．3．1 BPA和DES单独及联合暴露对发育相关基因表达的影响

7．3．2 主成分分析

7．4 本章小结

第8章 结论、创新点及展望

8．1 主要结论

8．2 创新点

8．3 展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文