变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆表达及其在葡萄糖代谢中的作用研究

摘要

2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、制药、化妆品、环保等领域，目前主要作为食品抗氧化剂异维生素C（D-异抗坏血酸）及其钠盐合成的前体。本论文以国内2KGA生产的主要工业用菌变形假单胞菌JUIM01为研究材料，采用PCR技术克隆该菌株的2-酮基葡萄糖酸激酶（2-ketogluconate kinase,KguK）的全长基因，并利用生物信息学在线分析工具和相关软件明确KguK蛋白的生物学信息。在此基础上，分别采用大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统和基因的无痕敲除技术，分析KguK蛋白在变形假单胞菌葡萄糖代谢中的作用，为2KGA工业化生产菌株的改造提供相关的理论依据。主要研究结果如下：
　　（1）采用PCR技术，从变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01中克隆了KguK的全长基因（kguK）。在此基础上，分别构建了重组菌株 Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK、BL21(DE3)/pET-42a-kguK、BL21(DE3)/pET-40b-kguK和Rosetta-gamiB(DE3)pLsS/pET-32a-kguK。生物信息学分析结果表明，KguK蛋白定位于细胞质中，是一种由305个氨基酸残基组成的、总平均亲水指数较低的蛋白，存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域。IPTG诱导结果显示，除E.coli BL21(DE3)/pET-40b-kguK外，其他的重组菌株均可表达KguK蛋白，但均以包涵体形式存在于细胞中。对E.coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK菌株表达的重组KguK蛋白包涵体进行的复性结果显示，重组蛋白KguK复性后的酶活为15.3 U/L。
　　（2）采用基因合成技术，获得了密码子优化的kguK基因。然后，采用酶切、无缝克隆、电转化和同源重组等技术，分别构建了胞外分泌表达型和胞内表达型的重组菌株Pichia pastoris X-33/pPICZαB-kguK和X-33/pPICZ(Δα) B-kguK。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示，在甲醇的诱导下，KguK蛋白在上述重组菌株中均可得到表达，但其胞外分泌量极低。采用亲和层析、透析和超滤浓缩等方法，对上述菌株表达的重组蛋白进行了分离纯化，获得了比活为736.8 U/g的KguK。
　　（3）根据P.plecoglossicida JUIM01的kgu操纵子的序列信息，采用重叠PCR技术构建了kguK基因缺失的片段ΔkguK；采用分子克隆技术，构建了重组敲除质粒pK18mobsacB-ΔkguK。在此基础上，以卡那霉素和蔗糖致死基因sacB作为筛选标记，对变形假单胞菌JUIM01的kguK基因进行无痕敲除，构建了kguK基因缺失菌株P.plecoglossicida JUIM01-ΔkguK。P.plecoglossicida JUIM01和P.plecoglossicida JUIM01-ΔkguK的2KGA发酵特性差异的比对结果显示，在发酵后期，JUIM01菌株和JUIM01-ΔkguK菌株均可利用发酵目的产物2KGA，但JUIM01-ΔkguK菌株的2KGA消耗率相对较低，说明在P.plecoglossicida JUIM01胞内可能还存在着其他的2KGA代谢途径。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 2-酮基葡萄糖酸激酶（KguK）概述

1.2 细菌中2KGA的合成与代谢

1.3 重组蛋白的表达

1.4 立题背景与意义

1.5 主要研究内容

第二章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆表达与生物信息学分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 本章小结

第三章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因在毕赤酵母中的表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 本章小结

第四章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的敲除及其对2KGA发酵特性的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 存在问题与展望

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文