嗜热子囊菌产耐热木聚糖酶的条件及酶学性质的研究

摘要

木聚糖酶主要以内切方式随机作用于木聚糖主链骨架的β-1,4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，现已在食品、饲料、纺织等领域应用广泛。与常温木聚糖酶相比，耐高温木聚糖酶具有催化效率高、防止污染、降低成本等优势，已成为国内外研究的热点之一，而嗜热真菌是主要的耐热木聚糖酶生产菌株。因此，本论文首先从高温堆肥和温泉等处的土壤中筛选出嗜热产耐热木聚糖酶的菌株，对其进行鉴定、培养条件优化，进而对其所产的耐热木聚糖酶进行分离纯化和酶学性质解析。
　　主要的研究结论如下：
　　(1)以江苏句容高温堆肥和湖北咸宁热泉出水口等处的土壤为原料，采用稀释涂布、刚果红染色以及胞外酶活测定的方法，筛选到编号为M1-M10等10株产耐热木聚糖酶的菌株。其中，M2菌株可同时分泌木聚糖酶（Xyn）和纤维素酶（CMC和FPA）等，且木聚糖酶活最高（34.58 U/mL）；经形态学、ITS序列同源性和系统进化树等分析确定其为嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）；现该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号为CGMCC NO.11334）；T.aurantiacus CGMCC11334在45℃条件下发酵8 d后Xyn最大达到39.07 U/mL。
　　(2)利用SPSS进行主成分分析，构建了催化水解玉米芯的综合水解能力指数（XCHI）；然后以XCHI为自变量，水解玉米芯的还原糖得率为因变量进行回归分析，回归分析模型证明了综合水解能力XCHI与糖得率之间存在相关关系，以XCHI为响应值，正交实验优化得到T. aurantiacus CGMCC11334产Xyn水解玉米芯能力的最适培养基组成为：麸皮16g/L、微晶纤维素7g/L、牛肉浸膏4g/L、玉米浆3g/L、小麦蛋白胨4 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO42.0 g/L、CuSO40.15 g/L、FeSO40.05 g/L、VB10.15 g/L；在此条件下，Xyn、CMC和FPA的活性分别为135.12 U/mL、1.95 U/mL和1.68 U/mL，XCHI为1649.44。
　　(3)采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow层析和Sephadex G-75等对Xyn纯化，其回收率为36.5%，纯化倍数为5.27；SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定了其分子质量为31.0 kDa，并预测了其结构特征。纯化的Xyn的酶学性质结果表明，其最适反应温度和最适反应pH分别为75℃和5.0；Xyn具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，在30~80℃和pH2.0~10.0条件下残留酶活分别为80%和70%以上。Mg2+和Ag+促进Xyn相对酶活至120.0%和119.6%；而Co2+、Cu2+和Mn2+抑制Xyn相对酶活至48.3%、96.5%和20.7%。Xyn的Km值为4.81 mg/mL，Vmax为476.2 mg/(min·mL)。Xyn水解产物主要为木二糖，据水解产物和空间构型可初步判断该酶为第10家族的内切木聚糖酶。

目录

声明

缩略词表

第一章 绪论

1.1高温菌和高温菌酶

1.2木聚糖

1.3木聚糖酶的研究进展

1.4木聚糖酶的应用

1.5 本课题的研究背景及研究内容

第二章 产耐热木聚糖酶菌株的筛选

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 T. aurantiacus产耐热木聚糖酶最大水解活性的培养条件优化

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4结果与讨论

3.5本章小结

第四章 T. aurantiacus产耐热木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质的研究

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法

4.4结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 全文总结及展望

5.1 全文主要结论

5.2 存在问题及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位阶段发表的论文