人胚胎干细胞的神经干细胞诱导分化及神经干细胞分泌的微囊泡对坐骨神经缺损性损伤的修复作用研究

摘要

研究背景： 由于地震、车祸等灾难的发生，坐骨神经等周围神经的损伤是临床的常见疾病。目前，自体神经移植仍然是修复周围神经损伤的主要方法，但是自体神经移植法具有供体来源有限、增加供区创伤以及残留供区感觉功能障碍等缺陷。周围神经再生是现阶段神经生物学领域的研究重点，组织工程领域的一些新发现为长节段缺损性损伤提供了新手段。神经干细胞（neural stem cells,NSCs）可分化为各种类型的神经细胞，将其移植到损伤处可促进轴突再生以及髓鞘形成。课题组此前通过培养人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）发现胚胎干细胞可以自发分化形成神经干细胞。由此我们推测这种人胚胎干细胞能够在特定条件下定向诱导分化成纯度较高的神经干细胞（ human embryonic stem cell derived-neural stem cells，hESC-NSCs）。由于神经干细胞来源的局限性，从hESCs分化而来的NSCs显得尤为重要。能否高纯度、高产量的获得NSCs是其能否应用到临床细胞治疗的关键问题。我们猜测，hESC-NSCs同胎脑来源的NSCs具有同样促进轴突再生的作用，对此后续的研究表明，hESC-NSCs确实可以通过间接作用促进轴突再生。现在越来越多的研究表明NSCs发挥修复神经损伤的作用不是通过细胞直接整合而是通过分泌因子发挥作用，并且由于NSCs是有核的活细胞，具有形成肿瘤的风险。微囊泡（microvesicles，MVs）是从细胞条件培养基中分离得到的活性有形成分，是细胞同周围细胞或环境进行信息和物质传递的一种物质。并且我们组之前已经研究证明过间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源的微囊泡（MSCs-MVs）可以促进坐骨神经压榨性损伤后的再生修复。因此，我们猜测人胚胎干细胞源神经干细胞分泌的微囊泡（microvesicles released from human embryonic stem cell derived-neural stem cells， hESC-NSC-MVs）与MSCs-MVs具有类似的促进轴突再生的功能，并对其展开进一步的研究。 研究目的： 研究人胚胎干细胞的神经干细胞诱导分化及胚胎干细胞源神经干细胞分泌的微囊泡对大鼠坐骨神经5mm缺损性损伤的修复作用。 研究方法： （1）将无饲养层培养的hESCs定向诱导为神经干细胞，并利用细胞形态学、免疫荧光、PCR的方法进行鉴定。 （2）利用PCR和流式细胞术对神经干细胞经过贴壁-球转化（AST）后提高干性进行说明。 （3）收集hESC-NSCs的无血清培养基（条件培养基），运用超速离心法提取微囊泡。 （4）将hESC-NSC-MVs与背根神经节共培养，测定轴突的长度。 （5）建立SD大鼠坐骨神经缺损性损伤模型，应用坐骨神经功能指数 （sciatic nerve functional index，SFI ）、HE 染色、Masson染色等方法评价hESC-NSC-MVs对大鼠坐骨神经损伤修复作用。 研究结果： （1）hESCs可以分化为神经干细胞，并且神经干细胞相关标志Nestin，Pax6等在P8 NSCs附近表达最高。 （2）神经干细胞经过AST，神经干细胞相关标志Nestin，Pax6等表达升高，干性增强。 （3）hESC-NSC-MVs与背根神经节共培养的再生轴突长度优于PBS组。 （ 4 ）成功的构建出大鼠坐骨神经缺损性损伤模型。神经损伤后 12 周， hESC-NSC-MVs组受损侧后肢形态学恢复和再生轴突的增加都较hESC-NSCs组和PBS组明显。 结论： （1）hESC可以分化为NSCs, hESC-NSCs表达神经干细胞标志。 （2） hESC-NSCs可以通过贴壁-球转化提高神经干细胞标志的表达以及增强干性。 （3）hESC-NSC-MVs对坐骨神经缺损性损伤具有修复作用。

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绪论

3.1.3 试剂

3.4.1 hESCs向hESC-NSCs分化

4.1.4 试剂