牛奶中主要有害污染物的表面增强拉曼光谱检测方法研究

摘要

随着牛奶消费量的增加，牛奶中有害物污染受到了消费者的极大关注。常规的检测方法或费时费力，或处理复杂、仪器昂贵、均不适用现场快速检测，因而开发新型分析方法已成为牛奶检测领域的研究热点。表面增强拉曼光谱技术（SERS）具有样本前处理简单、检测速度快、灵敏度高、光谱信息丰富、易操作等优点。因此，本研究以牛奶中三种主要有害污染物食源性致病菌、抗生素、重金属离子为检测对象，尝试将SERS技术与现有技术相结合，克服常规检测方法的局限性，实现牛奶中有害污染物的快速高灵敏检测。主要研究内容如下： 1. 牛奶中食源性致病菌的SERS检测方法研究。研究提出了一种基于粒距调控的竞争免疫SERS检测新方法，以鼠伤寒沙门氏菌为检测对象，首先制备了长径比适中、拉曼增强效果明显的金纳米棒（GNRs）作为SERS基底，然后通过静电吸附作用将鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体吸附至对巯基苯胺（PATP）修饰的GNRs表面；该核酸适配体保护GNRs在盐离子环境下的单分散状态，PATP作为标记分子报告SERS信号；当目标物与核酸适配体互补DNA共同存在时，它们竞争性地与核酸适配体发生特异性结合，导致核酸适配体失去对GNRs的保护，GNRs粒子间距减小，拉曼信号增强，以此实现检测。实验结果表明，鼠伤寒沙门氏菌线性检测范围为56-56×107 cfu/ml，检测限为9 cfu/ml；同时，对实际牛奶样本以标准加入法进行鼠伤寒沙门氏菌检测，加标回收率为98%-126%。研究表明，基于粒距调控竞争性免疫SERS方法检测牛奶中食源性致病菌思路是可行的。 2. 牛奶中抗生素残留的SERS检测方法研究。研究提出了一种竞争磁免疫SERS检测新方法，以四环素为检测对象，首先制备了磁性饱和度高、颗粒大小均一的磁性纳米微球，然后将其与四环素特异性核酸适配体结合，作为捕捉探针，用于四环素的捕获；PATP修饰的金纳米球/二氧化硅核壳材料与核酸适配体互补DNA结合，作为信号探针。当四环素存在时，四环素与捕捉探针上核酸适配体发生特异性结合，从而引起不同浓度信号探针在外磁场作用下的释放，通过测定被释放信号探针的拉曼光谱，根据PATP特征峰位置获取拉曼光谱强度，建立其与四环素浓度关系的标准曲线，实现检测。实验结果表明，四环素线性检测范围为0.001-100 ng/mL，检测限为0.001 ng/mL；同时，对实际牛奶样本以标准加入法进行四环素检测，加标回收率为97%-120%。研究表明，基于竞争磁免疫SERS方法检测牛奶中抗生素残留思路是可行的。 3. 牛奶中重金属离子的SERS检测方法研究。研究提出了一种基于罗丹明衍生物R开环反应的SERS检测新方法，以重金属汞离子为检测对象，首先制备了颗粒大小均一、拉曼增强效果明显的金/银核壳纳米立方块作为SERS基底，然后将其与罗丹明衍生物R结合，作为捕捉探针，用于重金属汞离子的捕获。当汞离子存在时，汞离子与罗丹明衍生物R分子结构中螺环部位发生开环反应，并发生螯合作用，实现汞离子的捕获；通过测定加汞后混合物的拉曼光谱，建立特征峰拉曼光谱强度与汞离子浓度关系的标准曲线，实现检测。实验结果表明，汞离子线性检测范围为0.01-1000 ppm，检测限为5.16 ppb；同时，对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测，加标回收率为98.83%-110%。研究表明，基于罗丹明衍生物R开环反应的SERS方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。 4. 基于SERS和化学计量学的牛奶有害污染物快速检测方法研究。在前三章研究基础上，进一步探索了更为快速便捷的检测方法，以满足牛奶中有害污染物现场快速检测的需求。研究仍以重金属汞离子为检测对象，首先优选出金纳米球/二氧化硅作为SERS基底，将其与不同浓度梯度的重金属汞离子混合，测其拉曼光谱；然后运用卷积平滑-一阶导数法对光谱进行预处理，消除基线偏移、漂移和噪声干扰的影响；接着分别利用遗传算法（Genetic Algorithm，GA）和蚁群算法（Ant Colony Optimization，ACO）优选出预处理后拉曼光谱的特征变量；最后有比较地利用两种线性（MLR与PLS）和两种非线性（BPANN与BP-Adaboost）算法建立了汞离子定量检测模型。实验结果表明，ACO优选BP-Adaboost模型对汞离子含量预测结果最佳，预测集相关性系数为0.997，预测集均方根误差为0.092；同时，对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测，加标回收率为98.3%-115%。研究表明，基于SERS和化学计量学方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。 5. 基于SERS/荧光双模态体系的牛奶有害污染物检测方法研究。在前四章研究基础上，进一步探索了SERS/荧光双模态检测新思路，以提高检测方法的广谱适用性。研究仍以重金属汞离子为例，首先利用制备的磁性纳米微球与汞离子特异性核酸适配体结合，作为捕获探针，用于汞离子的捕获；优化制备金银/石墨烯-上转换纳米复合材料与汞离子核酸适配体互补DNA结合，作为双模态信号探针。当汞离子存在时，汞离子与捕捉探针上核酸适配体发生特异性结合，从而引起不同浓度信号探针在外磁场作用下的释放，随后测定上清液中信号探针拉曼及荧光光谱，分别建立拉曼/荧光强度与汞离子浓度关系的标准曲线，实现双模态检测。实验结果表明，基于SERS技术的汞离子线性检测范围为0.001-800 ppm，检测限为0.32 ppb。基于荧光光谱技术的汞离子线性检测范围为0.001-100 ppm，检测限为0.001 ppm；同时，对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测，加标回收率分别为99.23%-110%和96.98%-109%。研究表明，基于SERS/荧光技术的双模态方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。

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Jiangsu University

摘 要

ABSTRACT

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第一章 绪 论

1.1 引言

1.1.1 我国乳业的发展状况

1.1.2 我国乳业的安全现状

1.1.4 现有的牛奶有害污染物检测技术

1.2表面增强拉曼光谱技术

1.2.1 SERS技术简介

1.2.2 SERS信号增强机制

1.2.3 SERS技术应用现状及存在问题

1.3 本研究目的、内容及技术路线

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容与技术路线

1.4 本章小结

第二章 牛奶中食源性致病菌的SERS检测方法研究

2.1 引言

2.2 本实验材料与方法

2.2.1 试剂与材料

2.2.2 仪器与设备

2.2.3 对巯基苯胺修饰的金纳米棒的制备

2.2.4 鼠伤寒沙门氏菌样本准备

2.2.5 检测原理

2.2.6检测步骤

2.2.7 实际牛奶样品的前处理

2.3 结果与讨论

2.3.1 表征

2.3.2 实验条件的优化

2.3.3 标准曲线的建立

2.3.4 特异性评估

2.3.5 实际牛奶样本中鼠伤寒沙门氏菌的检测

2.4 本章小结

第三章 牛奶中抗生素残留的SERS检测方法研究

3.1 引言

3.2 本实验材料与方法

3.2.1 试剂与材料

3.2.2 仪器与设备

3.2.3 捕捉探针的制备

3.2.4 信号探针的制备

3.2.5 检测原理

3.2.6检测步骤

3.2.7 实际牛奶样品的前处理

3.3 结果与讨论

3.3.1 捕捉探针的表征

3.3.2 信号探针的表征

3.3.3 实验条件的优化

3.3.4 标准曲线的建立

3.3.5 特异性评估

3.3.6 实际牛奶样品中四环素的检测

3.4 本章小结

第四章 牛奶中重金属离子的SERS检测方法研究

4.1 引言

4.2 本实验材料与方法

4.2.1 试剂与材料

4.2.2 仪器与设备

4.2.3 金纳米微球的制备

4.2.4 金/银核壳纳米立方块的制备

4.2.5 罗丹明衍生物R的制备

4.2.6 捕捉探针的制备

4.2.7 检测原理

4.2.8 检测步骤

4.2.9 实际牛奶样品的前处理

4.3 结果与讨论

4.3.1 捕捉探针的表征

4.3.2 标准曲线的建立

4.3.3 特异性评估

4.3.4 实际牛奶样品中重金属汞离子的检测

4.4 本章小结

第五章 基于SERS和化学计量学的牛奶有害污染物快速检测方法研究

5.1 引言

5.2 本实验材料与方法

5.2.1 试剂与材料

5.2.2 仪器与设备

5.2.3 SERS基底的制备

5.2.4 拉曼光谱采集和预处理

5.2.5 特征变量筛选

5.3 结果与讨论

5.3.1 表征

5.3.2 拉曼光谱分析及预处理

5.3.3 最优特征变量筛选

5.3.4 模型建立与分析

5.3.5 实际牛奶样品中重金属汞离子的检测

5.4 本章小结

第六章 基于SERS/荧光双模态体系的牛奶有害污染物检测方法研究

6.1 引言

6.2 本实验材料与方法

6.2.1 试剂与材料

6.2.2 仪器与设备

6.2.3 捕捉探针的制备

6.2.4 双模态信号探针的制备

6.2.5 检测原理

6.2.6 检测步骤

6.2.7 实际牛奶样品的前处理

6.3 结果与讨论

6.3.1 捕捉探针的表征

6.3.2 双模态信号探针的表征

6.3.3 标准曲线的建立

6.3.4 特异性评估

6.3.5 实际牛奶样品中重金属汞离子的检测

6.4 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 研究结论

7.2 研究主要创新点

7.3 研究展望

参考文献

致 谢

博士期间发表论文和取得成果