杏鲍菇多糖的降血脂活性评价及其泡腾片的制备工艺研究

摘要

高脂血症是一种常见的脂质紊乱疾病，主要表现为血清中总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平升高或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平降低。目前，他汀类、贝特类等药物在临床中广泛用于调节血脂水平，但这些化学药物通常伴随有严重的不良反应，如肝肾损伤，药物依赖性，药物拮抗作用和耐药性等等。天然药物多糖广泛存在于动物，植物和微生物中，表现出一系列优秀的生物活性，包括抗肿瘤，抗氧化，降血糖，降血脂，抗疲劳，免疫调节和基因治疗等，正受到越来越多的关注。杏鲍菇（P. eryngii）作为一种药食两用真菌，含有丰富的营养成分和生物活性物质，其主要有效成分之一的杏鲍菇多糖具有多种药理学活性，针对杏鲍菇多糖的物理性质、化学结构及其活性成分进行深入研究有利于杏鲍菇多糖的开发和应用。本论文对杏鲍菇多糖进行了相对系统的研究，包括杏鲍菇多糖的提取、分离、纯化，结构鉴定以及活性评价，尝试揭示杏鲍菇多糖的构象与其生物活性的联系，并对杏鲍菇多糖进行泡腾片制剂的研究。 第一章 综 述 本章对食用菌多糖进行了综述，同时，引出本文的研究对象，为本课题的实验设计提供理论支持。 第二章 杏鲍菇多糖的分离和纯化 本章在单因素试验的基础上，采用正交设计试验对杏鲍菇子实体进行多糖提取工艺优化，确定提取杏鲍菇子实体中多糖的最佳工艺条件为：料液比1:40、提取时间2 h、提取温度100℃、醇沉浓度90%，此条件下杏鲍菇粗多糖的得率为17.2%。通过比较 Sevag 法、三氯乙酸法和酶法三种除蛋白方法，确定了 Sevag法为最佳除蛋白方法，经此法除蛋白后杏鲍菇多糖（PEP）中的蛋白含量为0.4%。 本章首次通过D101大孔吸附树脂和DEAE-52纤维素从PEP中分离出两个组分，命名为PPEP-1和PPEP-2。经高效液相色谱检测，PPEP-1和PPEP-2均显示单一的对称峰，分子量分别为223 kDa和12 kDa；苯酚硫酸法测定出PPEP-1和PPEP-2中的总糖含量分别为98.23%和97.59%；糖醛酸实验测定出PPEP-1和PPEP-2 中的糖醛酸含量分别为 0.42%和 0.37%；紫外全波长扫描显示，PPEP-1和PPEP-2在280 nm和260 nm处都无吸收峰，说明两者均不含蛋白质和核酸。以上结果证明PPEP-1和PPEP-2均为纯化成功的均一多糖。 第三章 PPEP-1和PEPE-2的结构鉴定 本章进一步鉴定了PPEP-1和PPEP-2的结构。单糖组成结果显示，PPEP-1主要由甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和木糖组成，其摩尔百分比分别为23.04％， 4.34％，64.16％，5.99％和6.14％。PPEP-2主要由甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，木糖和岩藻糖组成，摩尔百分比分别为34.67％，0.81％，56.81％，7.38％，0.33％。根据红外光谱（IR）和一维核磁氢谱（1H NMR）扫描结果，PPEP-1和PPEP-2都具有吡喃糖构型和α构型。刚果红反应结果表明PPEP-2结构中具有三螺旋构象，而PPEP-1不存在三螺旋构象。原子力显微镜结果显示出PPEP-1具有比PPEP-2 更加高度聚集的糖链构型。扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察到 PPEP-1的糖链之间的缠结较PPEP-2更加紧密 第四章 PPEP-1和PPEP-2的降血脂活性研究 本章运用高脂鼠粮喂食和腹腔注射Poloxamer 407（P-407）诱导建立了两种小鼠高血脂模型，以研究 PPEP-1 和 PPEP-2的降血脂功能。实验组分别口服给予剂量为400 mg/kg的PEP、PPEP-1和PPEP-2。试剂盒测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量，并对小鼠的肝脏组织进行病理学检测。结果表明，在高脂鼠粮喂食诱导的小鼠高血脂模型中，与模型组相比，杏鲍菇多糖治疗组 PEP 和PPEP-1能显著降低血清TC、TG、LDL-C水平，显著提高血清HDL-C水平（P<0.05或P<0.01），且PPEP-1对血清TC、TG、LDL-C的降低率要高于PEP。肝脏组织病理学切片结果显示经PPEP-1 和 PPEP-2治疗后，高血脂小鼠的肝组织结构基本恢复正常，脂肪颗粒明显下降，肝细胞形态相对整齐，肝脏细胞受损情况显著好转。在P-407诱导的小鼠高血脂模型中，与模型组相比，杏鲍菇多糖治疗组PEP、PPEP-1 和 PPEP-2 均能显著降低血清 TC、TG、LDL-C 水平（P<0.05 或P<0.01），其中，PPEP-1对血清TC、TG、LDL-C水平的降低率均高于PEP。两种模型结果表明PPEP-1可能是杏鲍菇多糖中主要的降血脂物质。本章还探讨了杏鲍菇多糖的降血脂作用可能归因于它们的链构象而不是螺旋构象。 第五章 杏鲍菇多糖泡腾片的制备与评价 本章制备了杏鲍菇多糖泡腾片并对其进行质量分析。在前期实验确定酸源、碱源、润滑剂和填充剂的基础上，以崩解时限为考察指标，设计正交试验筛选泡腾片处方中的杏鲍菇多糖、崩解剂、润滑剂的用量，获得最佳处方配比。结果确定了最佳的工艺处方为：杏鲍菇多糖用量为15%，碳酸氢钠和柠檬酸的用量各为25%，润滑剂（PEG6000）的用量为10%，填充剂（甘露醇）的用量为25%。在此处方下制得的泡腾片重量差异误差范围在5%以内，崩解时间小于5 min，pH值在5.9 ~ 6.3范围内变化，平均硬度大于4 kg，经检测的质量评价均符合药典2015版的各项要求，说明该配方有良好的可靠性和可行性。

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摘 要

Abstract

引 言

第一章 综述

1.1 食用菌多糖的提取技术

1.1.1 水提醇沉法

1.1.2 超声波提取法

1.1.3 酶解法

1.1.4 微波法

1.1.5 超临界CO2萃取

1.2 食用菌多糖的分离纯化技术

1.2.1 除蛋白

1.2.2 脱色、除小分子杂质

1.2.3 多糖的纯化技术

1.2.4 食用菌多糖的纯度测定

1.3 食用菌多糖的结构鉴定技术

1.3.1 紫外光谱（UV）法

1.3.2 红外光谱（IR）法

1.3.3 核磁共振（NMR）法

1.3.4 高效液相色谱（HPLC）法

1.3.5 电泳法

1.3.6 化学法

1.3.7 刚果红反应

1.3.8 原子力显微镜（AFM）

1.3.9 扫描电子显微镜（SEM）

1.4 食用菌多糖的生物活性研究现状

1.4.1 抗肿瘤作用

1.4.2 抗氧化作用

1.4.3 降血脂作用

1.4.4 降血糖作用

1.4.5 保肝作用

1.5 多糖的制剂研究现状

1.5.1 脂质体

1.5.2 微丸

1.5.3 注射剂

1.5.4 泡腾片

1.6 选题目的及主要研究内容

第二章 杏鲍菇多糖的分离和纯化

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器

2.1.2 材料与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 杏鲍菇子实体的预处理

2.2.2 杏鲍菇粗多糖的提取

2.2.3 单因素考察

2.2.4 正交试验设计

2.2.5 粗多糖除蛋白工艺研究

2.2.6 蛋白质含量的测定

2.2.7 杏鲍菇多糖的纯化

2.2.8 PEP的纯度及分子量测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 单因素试验结果

2.3.2 正交试验设计结果

2.3.3 粗多糖除蛋白结果

2.3.4 D101大孔吸附树脂柱层析

2.3.5 DEAE-52纤维素柱层析

2.3.6 多糖含量测定

2.3.7 葡萄糖醛酸含量测定

2.3.8 紫外全波长扫描

2.3.9 元素分析

2.3.10 PPEP-1和PPEP-2的分子量测定

2.4 本章小结

第三章 PPEP-1和PEPE-2的结构鉴定

3.1 仪器与试剂

3.1.1 仪器

3.1.2 试剂

3.2 实验方法

3.2.1 单糖组成分析

3.2.2 红外光谱分析

3.2.3 1H NMR分析

3.2.4 刚果红实验

3.2.5 原子力显微镜（AFM）分析

3.2.6 扫描电子显微镜（SEM）分析

3.2.7 透射电子显微镜（TEM）分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 单糖组成结果

3.3.2 IR光谱分析结果

3.3.3 1H NMR分析结果

3.3.4 刚果红反应结果

3.3.5 AFM分析结果

3.3.6 SEM分析结果

3.3.7 TEM分析结果

3.4 本章小结

第四章 PPEP-1和PPEP-2的降血脂活性考察

4.1 实验材料、试剂与仪器

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验动物

4.1.3 实验试剂

4.1.4 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 动物分组

4.2.2 血样处理及血脂测定

4.2.3 肝脏组织切片

4.2.4 数据分析

4.3 结果与分析

4.3.1 杏鲍菇多糖在高脂鼠粮饲喂致高血脂小鼠中的降血脂活性

4.3.2 杏鲍菇多糖在P-407致高血脂小鼠中的降血脂活性

4.3.3 PPEP-1和PPEP-2的构效关系

4.4 本章小结

第五章 杏鲍菇多糖泡腾片的制备与评价

5.1 实验材料、试剂与仪器

5.1.1 实验材料

5.1.2 试剂

5.1.3 仪器

5.2 实验方法

5.2.1 杏鲍菇多糖泡腾片的制备工艺

5.2.2 酸源的选择

5.2.3 碱源的选择

5.2.4 润滑剂的选择

5.2.5 填充剂的选择

5.2.6 杏鲍菇多糖添加量的确定

5.2.7 崩解剂的配比选择及用量确定

5.2.8 正交试验优化多糖泡腾片处方

5.2.9 杏鲍菇多糖泡腾片的质量考察

5.3 结果与讨论

5.3.1 多糖添加量的确定

5.3.2 碱酸配比的确定

5.3.3 正交试验结果

5.3.4 杏鲍菇多糖泡腾片的质量考察

5.4 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

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