LncRNA Pvt1调控G-MDSCs免疫抑制功能的实验研究

摘要

目的：初步探讨长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）Pvt1对粒细胞样髓源抑制性细胞（granulocytic myeloid-derived suppressor cells, G-MDSCs）免疫抑制功能的调控作用，并分析其潜在的调控机制，为进一步寻找肿瘤免疫治疗新靶点提供实验基础。 方法： （1）磁珠分选野生型小鼠脾脏来源的CD11b+Ly6G+G-MDSCs，磁珠富集联合流式细胞仪分选Lewis肺腺癌移植瘤模型小鼠肿瘤组织来源的CD11b+Ly6G+G-MDSCs，流式细胞术（flow cytometry, FCM）分析细胞纯度，将上述细胞进行小鼠Arraystar LncRNA表达谱芯片检测（委托上海康成生物技术公司），筛选表达差异明显的lncRNA，利用实时荧光定量PCR（real time fluorescene quantitative PCR, qRT-PCR）验证芯片检测结果；此外，利用qRT-PCR检测荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达情况。 （2）分析Arraystar LncRNA表达谱芯片，筛选lncRNA Pvt1可能调控的下游靶分子，利用qRT-PCR验证芯片检测结果。在此基础上，利用qRT-PCR检测c-myc在荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中的表达差异。利用小鼠lncRNA Pvt1特异性小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）（si-Pvt1）敲减荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中的lncRNA Pvt1，qRT-PCR检测G-MDSCs中c-myc mRNA水平的变化、Western-blot检测c-myc蛋白水平的变化。 （3）为了确定lncRNA Pvt1对G-MDSCs免疫抑制功能的影响，利用si-Pvt1敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中的lncRNA Pvt1。通过 3H-胸腺嘧啶核苷（[3H]-thymidine, 3H-TdR）掺入法检测CD4+T细胞增殖能力的变化，FCM检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）表达的变化，比色法检测精氨酸酶1（arginase 1, Arg1）活性的改变。此外，体外利用IL-6和GM-CSF联合诱导G-MDSCs，qRT-PCR比较骨髓中直接分选的G-MDSCs与体外诱导的G-MDSCs中lncRNA Pvt1表达的差异，CFSE检测CD4+T细胞增殖能力的变化，FCM检测ROS表达的变化，比色法检测Arg1活性的变化。 （4）将1×106个si-Pvt1敲减G-MDSCs和0.8×106个小鼠Lewis肺腺癌细胞混合后皮下注射C57BL/6小鼠，连续监测肿瘤的生长情况，FCM检测荷瘤小鼠脾脏、局部引流淋巴结（draining lymph nodes, dLN）、肿瘤组织中Ⅰ型辅助型T细胞（Th1）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）比例的变化。 （5）为了探究肿瘤局部缺氧环境是否是引起G-MDSCs细胞内lncRNA Pvt1变化的原因，qRT-PCR检测荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs与荷瘤小鼠脾脏来源G-MDSCs中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的表达情况。将耗氧袋置于密闭容器中形成缺氧环境，小鼠脾脏G-MDSCs在缺氧环境培养后，利用qRT-PCR与Western-blot检测HIF-1α的表达，qRT-PCR检测lncRNA Pvt1的变化；缺氧处理G-MDSCs的同时加入HIF-1α的抑制剂YC-1，qRT-PCR与Western-blot检测HIF-1α的表达，qRT-PCR检测lncRNA Pvt1的变化。 结果： （1）与野生型小鼠脾脏来源的G-MDSCs相比，荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1表达水平明显增高（p<0.001）；荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达水平呈现递增趋势（p<0.01）。 （2）C-myc在荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中表达明显高于野生型小鼠脾脏来源G-MDSCs（p<0.01），c-myc的表达在荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中也呈现递增趋势（p<0.001），与lncRNA Pvt1的变化一致。抑制荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达后，c-myc的表达明显下调（p<0.05）。 （3）肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达被抑制后，其对CD4+T细胞增殖的抑制作用明显减弱（p<0.05），Arg1活性显著降低（p<0.05），ROS表达水平也明显下降（p<0.01）。此外，与骨髓中直接分选的G-MDSCs相比，IL-6和GM-CSF联合诱导的G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用明显增强（p<0.001），Arg1的活性显著增加（p<0.001），ROS表达水平也明显升高（p<0.05）；与此同时，lncRNA Pvt1的表达水平显著增高（p<0.001）。 （4）注射Lewis肺腺癌细胞和转染si-Pvt1的G-MDSCs组的小鼠（si-Pvt1组）肿瘤体积明显小于对照组（p<0.05）。si-Pvt1组小鼠引流淋巴结中CTL细胞的比例明显高于对照组小鼠（p<0.05），但si-Pvt1组小鼠脾脏、肿瘤组织中Th1细胞和CTL细胞的比例与对照组小鼠无明显差异。 （5）荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中HIF-1αmRNA水平明显高于脾脏来源G-MDSCs（p<0.001）。小鼠脾脏来源G-MDSCs经缺氧处理后，HIF-1α的mRNA水平（p<0.05）显著上调，HIF-1α蛋白水平升高，lncRNA Pvt1的表达也明显上调（p<0.05）；G-MDSCs在缺氧处理的同时加入HIF-1α的抑制剂YC-1，lncRNA Pvt1的表达出现明显下调（p<0.001）。 结论：荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达上调，抑制G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达能减弱其免疫抑制功能。

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