粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆、定点诱变及其在毕赤酵母中的表达

摘要

漆酶(laccase)是一类含铜的多酚氧化酶，它以氧作为终电子受体，能催化许多化合物的氧化反应，其作用底物比较广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。漆酶在造纸工业、纺织工业、环境保护、生物资源利用、有毒环境污染物转化和新能源开发等诸多领域具有潜在的应用价值。粗糙脉孢菌Neurosporacrassa产生的漆酶(NCL)是一种有代表性的子囊菌漆酶，具有较好的耐热性能，最适作用pH为6(以愈创木酚为底物测定酶活)，其编码基因中只有一个内含子。本文主要研究NCL的基因工程菌构建、NCL的最适pH值定点诱变改造、NCL改造后的酶学性质以及NCL基因突变体的发酵条件。 采用连续延伸PCR技术从N.crassa染色体DNA中扩增出不含信号肽序列的NCL结构基因，将该结构基因插入巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点，构建成能够在P.pastoris胞外表达NCL基因的重组质粒pPIC9K/lacc，重组质粒以SacⅠ线性化后电转化尸.pastorisKM71。重组毕赤酵母在甲醇诱导下表达出NCL活性，最高酶活为2.94U/mL。SDS-PAGE结果显示重组毕赤酵母分泌表达的NCL分子量约为64.8kD。 设计引物时将NCL结构基因中的Val(缬氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)对应的碱基替换为Leu(亮氨酸)、His(组氨酸)、Met(蛋氨酸)对应的碱基，同样采用连续延伸PCR技术从重组质粒pPIC9K/lacc中扩增出NCL诱变基因。将NCL诱变基因插入P.pastoris分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点，构建成能够在P.pastoris胞外表达NCL诱变基因的重组质粒pPIC9K/lacc′，重组质粒以SacⅠ线性化后电转化P.pastorisKM71。重组毕赤酵母在甲醇诱导下表达出NCL活性，酶活与定点诱变前相比没有提高。 粗糙脉孢菌漆酶基因突变体和重组野生菌的发酵液8000r/min冷冻离心10min，取上清，冷冻干燥，加入10mL双蒸水溶解。再经过三次SephadexG-15凝胶柱和一次DEAESepharoseCL-6B凝胶柱层析分离处理，分别得到了重组突变酶和重组野生酶的纯酶溶液。SDS-PAGE结果显示纯化后的重组突变酶、重组野生酶均达到电泳均一，分子量约为64.8kD。酶学性质研究表明，重组突变酶的最适作用pH值由偏酸变为偏碱，pH稳定范围向碱性扩大，而重组突变酶的其他酶学性质(最适作用温度、热稳定性、金属离子的影响、潜在酶抑制剂的影响等)与重组野生酶相比没有改变。 系统研究了粗糙脉孢菌漆酶基因突变体在菌体生长和诱导表达两个阶段的摇瓶发酵条件。采用优化的碳源(20g/L的葡萄糖)、氮源(20g/L的玉米浆)，以培养基初始pH5.5，接种量2.5％，于220r/min、30℃下摇瓶培养N.crassa漆酶基因突变体，至第4天时，生物量达到最高值，OD600为5.362，比初始发酵条件下提高约20％；采用优化的碳源(0.5％甲醇)、氮源(20g/L玉米浆)，以培养基初始pH5.5，于220r/min、30℃下摇瓶培养N.crassa漆酶基因突变体，至第5天时，漆酶酶活达到最高值，为3.88U/mL(以愈创木酚为底物测定酶活)，比优化前提高约31％。扩大到5L发酵罐后N.crassa漆酶基因突变体的漆酶酶活最高可达3.96U/mL。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章粗糙脉孢菌漆酶合成条件的研究

第三章粗糙脉孢菌漆酶基因的连续PCR扩增和克隆表达

第四章粗糙脉孢菌漆酶基因的定点诱变及其克隆表达

第五章重组突变酶的分离纯化和酶学性质研究

第六章粗糙脉孢菌漆酶基因突变体菌体生长及合成漆酶的发酵条件研究

论文结论

论文创新点

缩略语

附录 粗糙脉孢菌漆酶基因的全序列

致 谢

博士期间发表的文章