脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白聚集机理

摘要

各种大豆蛋白均以脱脂大豆为原料制备，但脱脂豆粕中残留的不饱和脂质容易在脂肪氧合酶的催化下发生氧化，且脂质-蛋白质体系中的氧化脂质易诱导蛋白质聚集，从而引起蛋白质的营养和功能性质发生不期望的变化。因大豆蛋白聚集而涉及的内容很多，本文重点研究由脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白聚集的机理。 通过建立由亚油酸、脂肪氧合酶和低脂质含量的大豆蛋白所组成的模拟反应体系，应用化学分析、电泳、凝胶色谱和激光光散射等方法研究了反应后大豆蛋白的聚集情况。结果发现，在模拟体系中同时添加亚油酸和脂肪氧合酶会使反应后样品的混浊度与表面疏水性增加，巯基与二硫键的含量下降。SDS-PAGE显示大豆蛋白7S和11S的各个亚基均参与了反应，尤其是7S部分反应更为明显，表明聚集体的形成涉及包括二硫键在内的共价交联。原态电泳、凝胶色谱和激光光散射分析进一步证实，反应后的大豆蛋白形成了相对高分子质量和颗粒粒径较大的聚集体。 采用荧光光谱结合蛋白质氧化值、氨基酸组成、TBA值、GC-MS和可溶蛋白质的表面疏水性等分析，探讨了脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用。在脂肪氧合酶的催化作用下，亚油酸氧化产生的氢过氧化物及其降解产物与大豆蛋白作用，反应后大豆蛋白的荧光光谱最大激发波长在350nm，最大发射波长在440nm。脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用，在LRSP+LA+LOX模拟体系中产生荧光物质。该荧光物质部分可溶于氯仿-甲醇溶液的有机相中，其荧光光谱最大激发波长在350nm，最大发射波长在430nm，且荧光强度随着反应程度的增加而增强。伴随着荧光物质的形成，反应后大豆蛋白的蛋白质氧化值增加，可溶性蛋白质的表面疏水性降低，色氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和半胱氨酸(胱氨酸)等氨基酸含量减少，蛋白质分子间形成C-C或C-N形式的共价交联并进一步导致大豆蛋白聚集。 导致大豆蛋白聚集体形成的自由基由氧化亚油酸到大豆蛋白的迁移以及部分自由基类型的确定是通过电子顺磁共振(EPR)研究完成的。经脂肪氧合酶催化亚油酸的诱导，在大豆蛋白EPR波谱中检测到一个很强的源于肽链骨架α-碳原子或其侧链其它碳原子的自由基信号，其g值范围在2.0041-2.0054之间。此外，在碳自由基中场信号的低场区尚有一个额外的肩峰，它是硫自由基信号，其g值范围在2.019-2.028之间。在大豆蛋白发生上述变化的同时伴随着荧光强度的增加，表明蛋白分子之间和/或之内产生了共价交联。在大豆蛋白与脂肪氧合酶和亚油酸混合反应前，添加抗氧化剂能抑制自由基信号和荧光的发展；可使中场碳自由基信号降低35-65％。除了上述提及的自由基之外，通过改变微波功率测量EPR波谱，又确定了两种类型的自由基。具有较高反应活性的羟基自由基(·OH)源于自由基链反应和水分子；醛自由基源于大豆蛋白与脂肪氧合酶催化亚油酸氧化产生的降解产物的酶促反应。 应用傅立叶变换红外、激光拉曼和圆二色性光谱等方法研究了不同亚油酸浓度下脂肪氧合酶催化诱导产生的大豆蛋白聚集体的结构变化。当模拟反应体系中亚油酸浓度在3.14-6.09mmol/L范围之间时，拉曼光谱中归属于CH和CH2弯曲振动的谱带强度增强，而归属于位于非极性环境中的色氨酸和酪氨酸残基的谱带强度减弱；当亚油酸浓度达到7.51mmol/L时，又观察到相反的结果，这表明大豆蛋白质的聚集涉及疏水相互作用。此外，在蛋白质拉曼光谱中还观察到胱氨酸残基二硫键的伸缩振动变化。红外光谱分析表明，在模拟反应体系中，通过氢键形成的分子间β-折叠结构在蛋白质-蛋白质相互作用和聚集体形成中发挥着重要的作用。二级结构分析表明，反应后大豆蛋白α-螺旋减少，β-折叠增加，这在红外和拉曼光谱中已有明显的反映，而在圆二色性光谱分析中进一步得到证实。 通过模拟大豆蛋白质制备过程，探讨了脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对酸沉大豆蛋白部分性质的影响。扫描电镜发现，反应后大豆蛋白等电点聚集沉淀的颗粒更加规整致密。毛细管电泳分析表明，随着反应的进行，酸沉大豆蛋白各亚基的迁移时间延长、峰形展宽。紫外可见光谱分析证实，经不同时间反应后的大豆蛋白，其生色基团所处微环境发生了改变。SEC-HPLC和LLS分析表明，酸沉大豆蛋白的相对分子质量和流体力学体积随反应时间延长而增加，且粒径分布具有多态性。酸沉大豆蛋白溶液的特性粘度也随反应时间延长而增加。这些数据说明模拟反应体系中的蛋白质聚集行为和聚集程度随反应时间的不同而不同。 基于以上实验结果，我们认为，由脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白聚集的机理主要包括以下几个方面：(1)是中间产物自由基导致蛋白质分子的聚合，即亚油酸过氧化初级产物(主要是氢过氧化物)的裂解产生脂质自由基，脂质自由基作为引发剂通过抽氢使蛋白质分子变成自由基，后者引发聚合式链反应，导致蛋白质分子的聚合；(2)是亚油酸氧化的次生产物等导致蛋白质分子的交联，即亚油酸过氧化次生产物中的醛类化合物可与蛋白质分子的氨基等侧链基团发生作用导致多肽链的链内交联和链间交联；(3)是蛋白质分子的重新组装，即在脂质自由基和脂质过氧化的醛类产物进攻下参与反应的蛋白质，进一步通过疏水相互作用、静电相互作用和氢键等的作用，形成高分子的蛋白质聚集体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及其意义

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章脂肪氧合酶催化亚油酸氧化诱导大豆蛋白的聚集

第三章脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用研究

第四章脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白相互作用过程中自由基迁移的电子顺磁共振研究

第五章脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对大豆蛋白结构的影响

第六章脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对酸沉大豆蛋白性质的影响

主要结论

展望

论文创新点

致谢

附录攻读博士学位期间发表的论文