大麦多酚化合物的提取、纯化及功能性质研究

摘要

大麦是我国主要的农作物之一，含有丰富的营养成分和功能成分。如何综合有效的开发利用我国丰富的大麦资源是一项重要的课题。多酚物质具有抗氧化、抑菌、抗癌、抗老化等众多生理活性，目前已经成为开发研究的重点，而大麦是富含多酚物质的一种谷类作物，本课题选择大麦作为原料，以其中的多酚类化合物作为研究对象，先建立适合大麦的多酚定量方法，然后对大麦多酚的提取工艺进行了优化并对大麦中的多酚物质进行分离纯化和结构鉴定，最后对大麦多酚的体内外抗氧化活性进行了研究，为合理利用大麦资源提供理论依据。 对测定总酚和原花青素的两种比色法进行了系统研究，建立适合用于测定大麦提取液中多酚类物质含量的简易方法。结果表明，测定总酚的合适比色条件为：一定体积样品水溶液+0.2 mol/L的Folin-Ciocalteu试剂1.0 mL+15％碳酸钠溶液2.0 mL，定容至10 mL，室温下反应60 min后测定A<,760nm>。测定原花青素的合适比色条件为：0.5 mL样品水溶液+2.5 mL2％香草醛+2.5 mL30％硫酸，30℃避光反应15 min后测定A<,500nm>。这两种方法具有重现性好、回收率高，操作简单的特点。利用这两种方法对皮大麦和裸大麦中的总酚和原花青素进行测定，结果表明皮大麦中总酚和原花青素的含量均高于裸大麦，可作为提取所用的原料。 通过单因素和正交实验对用乙醇作为溶剂提取大麦多酚化合物的工艺进行优化，最佳条件为：乙醇浓度80％、温度60℃、料液比为1:15、提取时间6小时。采用响应面分析对超声辅助提取大麦多酚化合物的工艺条件进行了优化，最佳条件为：乙醇浓度65％，超声时间10 min，料液比1:27。超声辅助提取可大大缩短提取时间，总酚和原花青素的提取得率分别提高了约20％和50％。通过静态吸附实验从十二种大孔吸附树脂中筛选出的AB-8型树脂对大麦多酚吸附量大，解吸率高，适合于大麦多酚的富集。通过动态吸附实验得到它的最佳吸附条件为：上柱料液浓度1.0 mg/ml，pH6.0，上柱速率为2～3BV/h。3倍柱体积的70％乙醇以2BV/h的流速进行洗脱即可基本将大麦多酚类物质从树脂上解吸下来。用大孔树脂法富集大麦多酚物质，在纯度和回收率上要优于传统的有机溶剂萃取法。 利用柱色谱对大麦中的多酚类化合物进行分离纯化，得到4种纯度较高的化合物。利用样品的波长扫描、HPLC-MS以及核磁共振技术对化合物进行结构分析，确定其中三种化合物分别是儿茶素、桔儿茶素和儿茶素-(4α→8)-儿茶素(原花青素B<,3>)，另外一种推测是黄酮类物质苜蓿素，该种黄酮类物质在大麦中的发现未曾见过报道。 采用不同体系研究了大麦多酚粗提物、AB-8 树脂富集物和单体化合物的体外抗氧化功能。研究结果表明，大麦多酚提取物具有抗氧化功能，并且存在一定的效量关系，但在不同抗氧化体系中活性有所差异。还原能力从高到低为：Vc>桔儿茶素>儿茶素-(4α→8)-儿茶素>儿茶素≈BHT>富集物>粗提物。抑制亚油酸氧化的能力从高到低为： 儿茶素-(4α→8)-儿茶素≈儿茶素≈桔儿茶素>AB-8树脂富集物>乙醇粗提物≈Vc。对脂质体共轭二烯氢过氧化物和丙二醛的产生也具有明显的抑制作用，其强弱顺序依次为：苜蓿素>儿茶素≈儿茶素-(4α→8)-儿茶素≈桔儿茶素>富集物>粗提物>Vc。各样品对DPPH·自由基和超氧阴离子自由基[O<,2>·]都具有清除能力，其中三种单体化合物的对DPPH·自由基清除能力要强于Vc，桔儿茶素、儿茶素-(4α→8)-儿茶素和儿茶素的半清除浓度EC<,50>分别为：1.98μg/mL、2.07μg/mL、2.18μg/mL。AB-8树脂富集物对DPPH·自由基的EC<,50>远小于粗提物，分别为34.15μg/mL和236.63μg/mL。邻苯三酚．鲁米诺发光体系中，各样品对超氧阴离子自由基[O<,2>·]的清除能力强弱顺序为：Vc>桔儿茶素>儿茶素>儿茶素-(4α→8)-儿茶素>富集物>乙醇粗提物，半清除浓度EC<,50>分别为16.38μg/mL、32.87μg/mL、39.21μg/mL、49.52μg/mL、 55.57μg/mL和322.47μg/mL。在脱氧核糖体系中，粗提物和AB-8树脂富集物对羟基自由基[OH·]有一定的清除效果，而三个单体化合物中，儿茶素和原花青素B<,3>只显示出微弱的清除能力，桔儿茶素在此体系中还有促氧化的作用。由体外实验可知，多酚物质的抗氧化活性与分子结构密切相关，分子构型、B环上羟基的数量、聚合度对抗氧化活性都有一定影响。此外，抗氧化剂的抗氧化能力还与测定体系的具体情况，如pH值、温度、所在体系性质(水溶或油溶)有无酶或金属离子存在等有密切关系。 通过对喂食基础饲料和高脂饲料的小鼠灌胃大麦多酚的体内实验发现，灌胃大麦多酚能提高正常喂养小鼠的抗氧化能力，有利于正常情况下抗氧化应激损伤能力的增强。同时，大麦多酚还能通过抗氧化作用维持高脂饲料组小鼠体内氧化和抗氧化的动态平衡，降低氧化损伤。初步分析认为，大麦多酚提高小鼠的抗氧化功能可以通过两种途径实现，一是抑制脂质过氧化，清除氧化过程中产生的自由基，打断脂质氧化恶性循环的连锁反应，抑制膜结构上不饱和脂肪酸的过氧化，二是能提高体内抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活性，从而增强机体的抗氧化能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写符号说明

声明

第一章绪论

1.1大麦

1.1.1大麦的植物学特性及资源分布

1.1.2大麦的主要营养成分

1.1.3大麦的主要功能成分

1.1.4大麦的利用现状

1.2 多酚

1.2.1多酚的分类及结构

1.2.2多酚的生理功能

1.2.3多酚的应用

1.3大麦中酚类物质的研究进展

1.4立题背景及意义

1.5主要研究内容

参考文献

第二章比色法测定大麦多酚化合物

2.1前言

2.2材料与仪器

2.2.1实验材料与试剂

2.2.2主要仪器与设备

2.3实验方法

2.3.1样品处理

2.3.2 Folin-Ciocalteu试剂比色法测定总酚

2.3.3硫酸-香草醛比色法测定原花青素

2.3.4比色方法的评价

2.4结果与讨论

2.4.1 FC比色法测定总酚

2.4.2硫酸-香草醛比色法测定原花青素

2.4.3 FC比色法方法评价

2.4.4硫酸-香草醛比色法方法评价

2.4.5大麦样品中总酚和原花青素的测定

2.5本章小结

参考文献

第三章大麦多酚化合物的提取与富集

3.1前言

3.2材料与仪器

3.2.1实验材料与试剂

3.2.2主要仪器与设备

3.3实验方法

3.3.1总酚含量的测定

3.3.2原花青素含量的测定

3.3.3提取溶剂的筛选

3.3.4大麦多酚化合物传统溶剂提取条件的选择

3.3.5大麦多酚化合物超声辅助提取条件的选择

3.3.6大麦多酚化合物的富集-大孔吸附树脂的筛选

3.3.7有机溶剂法与AB-8树脂吸附法富集大麦多酚化合物

3.4结果与讨论

3.4.1提取溶剂的筛选

3.4.2大麦多酚化合物乙醇提取条件的选择

3.4.3大麦多酚化合物超声辅助提取条件的选择

3.4.4大麦多酚化合物的富集-大孔吸附树脂的筛选

3.4.5有机溶剂法与AB-8树脂吸附法富集大麦多酚化合物

3.5本章小结

参考文献

第四章大麦多酚化合物单体的分离、纯化及结构鉴定

4.1前言

4.2材料与仪器

4.2.1实验材料与试剂

4.2.2主要仪器与设备

4.3实验方法

4.3.1化合物的初步定性

4.3.2大麦多酚化合物的提取、分离及纯化

4.3.3大麦多酚化合物的结构鉴定

4.4结果与讨论

4.4.1化合物A的结构鉴定

4.4.2化合物B的结构鉴定

4.4.3化合物C的结构鉴定

4.4.4化合物D的结构鉴定

4.5本章小结

参考文献

第五章大麦多酚提取物体外抗氧化活性研究

5.1前言

5.2材料与仪器

5.2.1实验材料与试剂

5.2.2主要仪器与设备

5.3实验方法

5.3.1还原能力的测定

5.3.2亚油酸体系抗氧化能力的检测

5.3.3脂质体过氧化抑制能力的检测

5.3.4 DPPH·自由基的清除实验

5.3.5超氧阴离子自由基[O2-·]清除实验-化学发光法

5.3.6羟基自由基[HO·]清除实验-脱氧核糖降解法

5.4结果与讨论

5.4.1还原能力的测定

5.4.2亚油酸体系抗氧化能力的检测

5.4.3脂质体过氧化抑制能力的检测

5.4.4 DPPH·自由基的清除能力

5.4.5超氧阴离子自由基[O2-·]清除实验-化学发光法

5.4.6羟基自由基[HO·]清除实验-脱氧核糖降解法

5.4.7酚类化合物抗氧化活性与分子结构间关系

5.5本章小结

参考文献

第六章大麦多酚提取物体内抗氧化活性研究

6.1前言

6.2材料与仪器

6.2.1实验材料与试剂

6.2.2主要仪器与设备

6.3实验方法

6.3.1动物分组及喂养

6.3.2测试样品制备

6.3.3组织匀浆中蛋白质测定

6.3.4样品中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA的测定

6.3.5数据处理

6.4结果与讨论

6.4.1实验对小鼠体重及行为的影响

6.4.2血液和组织中T-AOC测定结果

6.4.3血清和组织中MDA含量测定结果

6.4.4血清和组织中SOD活性测定结果

6.4.5血清和组织中GSH-Px活性测定结果

6.5本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

附录

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢