酪蛋白非磷肽的制备及其ACE抑制活性的研究

摘要

酪蛋白中富含多种生物活性肽，酪蛋白磷酸肽(CPPs)是酪蛋白生物活性肽中被研究和开发最早的一种，具有结合矿物质的作用。一般在工业化生产CPPs过程中，有近80％的蛋白质副产物--酪蛋白非磷肽(CNPPs)未被合理利用，作为饲料或废物弃去。本论文中，在制备CPPs的同时回收其副产物CNPPs，并研究了大孔吸附树脂对它的脱盐效果及其中的血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽，为CNPPs的开发利用提供了理论基础。 论文首先研究了Alcalase水解酪蛋白生产CPPs和CNPPs的工艺条件，实验结果表明，Alcalase对酪蛋白作用的最佳条件是：底物浓度5％(w/v)，加酶量0.03mL·g-1蛋白质，温度60℃，pH值9.0。乙醇的浓度和酪蛋白的水解度(DH)对CPPs和CNPPs的得率以及CPPs的N/P(摩尔比)均有影响。当乙醇浓度70％(v/v)，DH值达到18％时，CPPs释放并沉淀完全，得率达到最高，为23.94％，N/P(摩尔比)是9.61，CNPPs得率为76.06％。CPPs和CNPPs的相对分子质量分布在200～5000之间，其中低于700的肽含量最高，分别为61.52％和67.26％。CNPPs中的疏水性氨基酸含量远高于CPPs。 由于在酪蛋白水解以及CPPs的沉淀过程中引入了大量无机盐，导致CNPPs产品的灰份含量高达20.88％，影响了对它活性的研究，更影响了它的品质，必须去除CNPPs中的无机盐，所以论文研究了大孔吸附树脂对CNPPs的脱盐效果。使用DA201-C型大孔树脂对CNPPs脱盐简便可行，60mg·mL-1的CNPPs溶液上柱，用紫外检测器检测流出液的A220nm，以A220nm=0.05为透过点，水洗后用70％(v/v)乙醇解吸，流速为140mL·h-1。CNPPs经大孔树脂处理后，脱盐率为95.40％，ACE抑制活性的IC50从0.35mg·mL-1降低到0.21mg·mL-1，而且多肽的回收率可以达到85％以上，同时该过程还伴随着明显的纯化作用。经体外消化实验发现，CNPPs经消化道酶作用后ACE抑制活性有所提高，说明在消化酶作用下，CNPPs中部分肽键被打断，成为更短的肽，短肽有益于抑制ACE活性。肽谱分析显示出CNPPs中肽的种类和组成非常复杂，这使得ACE抑制肽的分离纯化和结构鉴定成为一项比较困难但很有意义的工作。 为了充分了解CNPPs作为降血压功能因子的潜力，本论文利用凝胶过滤色谱和RP-HPLC从CNPPs中分离得到一种ACE抑制肽CNPPs-8-2。采用LC/ESI-MS结合氨基酸分析证明CNPPs-8-2相对分子质量为291.1，推测其一级结构氨基酸序列为Ser-Trp。测定该组分的ACE抑制活性，其IC50为92.8μmol·L-1。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1酪蛋白与其酶解产物生物活性多肽

1.1.1酪蛋白的来源、成分和结构

1.1.2酪蛋白水解物与功能性食品

1.1.3牛乳酪蛋白活性肽产品的开发和应用现状

1.2高血压

1.2.1高血压的分类

1.2.2高血压的危害

1.3 ACE与高血压

1.3.1 ACE

1.3.2 ACE对血压的调节作用

1.4 ACE抑制肽

1.4.1降血压机理

1.4.2结构与功能关系

1.4.3源于酪蛋白的ACE抑制肽

1.4.4源于其它食品蛋白质的ACE抑制肽

1.5立题背景及意义

1.6本论文主要研究内容

第二章Alcalase水解酪蛋白制备CNPPs

2.1前言

2.2材料和仪器

2.2.1实验材料

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1成分分析

2.3.2水解度(degree ofhydrolysis，DH)的测定

2.3.3 CPPs和CNPPs得率的计算

2.3.4 Alcalase水解酪蛋白工艺

2.3.5 CPPs和CNPPs的分离

2.3.6 CPPs和CNPPs相对分子质量分布测定

2.3.7氨基酸组成分析

2.3.8游离氨基酸的测定

2.4结果与讨论

2.4.1 Alcalase水解酪蛋白水解曲线

2.4.2 Alcalase水解酪蛋白工艺条件的探讨

2.4.3 CPPs和CNPPs的分离

2.4.4 CPPs和CNPPs的分子大小和组成

2.5本章小结

第三章CNPPs的脱盐及其性质的研究

3.1前言

3.2材料和仪器

3.2.1材料

3.2.2仪器

3.3实验方法

3.3.1大孔吸附树脂对CNPPs进行脱盐

3.3.2脱盐后CNPPs的性质测定

3.4结果与讨论

3.4.1紫外检测最佳波长的确定

3.4.2大孔吸附树脂对CNPPs的静态吸附能力

3.4.3大孔吸附树脂对CNPPs的动态吸附及解吸

3.4.4最佳样品浓度的确定

3.4.5最佳流速的确定

3.4.6脱盐效果

3.4.7脱盐后CNPPs产品的理化性质及体外消化稳定性

3.5本章小结

第四章 CNPPs中ACE抑制肽的分离纯化及结构分析

4.1前言

4.2材料和仪器

4.2.1材料

4.2.2仪器

4.3实验方法

4.3.1 ACE抑制活性的测定

4.3.2 Sephadex G-15分离纯化CNPPs

4.3.3氨基酸组成分析

4.3.4 RP-HPLC分离纯化CNPPs

4.3.5 ACE抑制肽的液质联用分析

4.4结果与讨论

4.4.1凝胶过滤色谱对CNPPs的分离

4.4.2 CNPPs经Sephadex G-15分离后各组分对ACE的抑制作用

4.4.3 CNPPs-8的氨基酸组成

4.4.4 CNPPs-8的紫外扫描图谱

4.4.5反相高效液相色谱分离纯化ACE抑制肽

4.4.6 CNPPs-8-2的结构分析

4.5本章小结

主要结论

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士期间发表的论文