重组枯草芽孢杆菌生产角质酶发酵条件优化

摘要

角质酶是一种多功能酶，属于丝氨酸酯酶，具有称作α/β水解酶折叠的共同结构框架的蛋白质。作为酯酶的一种，角质酶在工业产品和生产工艺中的应用表现出脂肪酶的特性，它既可以参与水解反应也可以参与合成反应。因此其在奶制品工业、洗涤剂工业、化妆品工业、甘油三酯、多聚体、表面活性剂、护肤产品、药物以及农业化学药品等方面都表现出潜在的应用。角质酶在纺织上的应用是近几年兴起的新的研究方向，在染色方面和传统工艺相比能够提高润湿性和水解纤维的能力，缩短处理时间、减少蒸汽和电力消耗以及保护环境等优点。 本论文以一株高积累角质酶的重组枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisWSH06—07)为出发菌株，以角质酶的高产量、高得率和高生产强度为目标，采用针对发酵过程的外因定性优化(基于微生物反应原理的培养环境优化技术)、内因定性优化(基于代谢特性的分阶段培养技术)等一系列技术对角质酶发酵过程进行优化，研究的主要结果如下： 1.种龄对发酵的影响较大，实验考察了种子的生长情况：9～22h为种子的对数期，种龄为11h，将种子接入培养基中有利于菌体的发酵。 2.采用基因工程菌进行发酵，质粒的稳定性和细胞内包涵体对产量影响很大。实验结果表明：在整个发酵过程中，质粒稳定性能维持90％以上。此外，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了细胞内没有包涵体，目的蛋白全部在发酵上清液中。 3.摇瓶水平上考察营养条件对B.subtilisWSH06—07生长和角质酶合成的影响；通过单因素实验和Plackett—Burman实验确定了蔗糖、蛋白胨以及硫酸镁是影响角质酶发酵的主要因素；在此基础上，采用响应面设计方法考察了各营养组分及其浓度的配比关系。实验结果表明：蔗糖和硫酸镁存在交互作用也是影响细胞生长和角质酶合成的主要因素。最终确定角质酶发酵的培养基组分为(g/L)：蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氢二钠12.54，磷酸二氢钾2.31，硫酸镁4.4。进一步确定较优的环境条件组合为：初始pH7.5、装液量75mL/500mL、接种量5％。 4.在3L发酵罐中研究了溶氧对角质酶分批发酵的影响。结果表明：在通气量恒定的情况下，不同搅拌转速对菌体干重(DCW)和角质酶产量没有较大影响。因此，在蔗糖浓度为32.5g/L且通气量控制在1.5vvm的前提下，将搅拌转速恒定在600r/min即可满足细胞生长和角质酶合成对溶氧的需求。 5.不同pH控制模式对角质酶分批发酵的影响有较大差异。在发酵过程中控制pH相对于不控制pH角质酶产量有所提高。基于发酵过程中不同pH对菌体比生长速率及比产物合成速率的变化，确定了pH两阶段控制策略，即0～4h时控制pH7.5，4h后将pH调至6.5。通过采用这一优化策略，角质酶酶活有了较大的提高，达170U/mL，生产强度为16.9kU/(L·h)，比恒定pH7.5控制模式下分别提高了122.6％和123.2％。 6.实验考察了温度对B.subtilisWSH06—07生长和产酶的影响。分批培养结果表明：温度在27℃～40℃范围内，较高温度对提高细胞生长速度有促进作用，但在40℃下质粒丢失严重，而较低温度有利于角质酶的合成。在深入分析不同温度下角质酶分批发酵动力学的基础上，提出了温度分阶段控制策略，即发酵前4h控制为温度37℃，4h后切换至30℃并保持到发酵结束。采用这一最优温度两阶段控制策略，最高酶活和生产强度为312.5U/(mL)、13.02KU/(L·h)，比37℃分别提高了83.4％、10.9％。因此温度两阶段控制策略对于提高角质酶产量具有实际效果。 7.实验考察了不同初糖浓度对角质酶分批发酵的影响，实验结果表明：仅通过提高初糖浓度难以实现细胞和角质酶高产量、高得率和高生产强度的有机统一。对此实验考察了分批补料、恒速流加培养方式对B.subtilisWSH06—07发酵生产角质酶的影响。结果表明：这两种补料培养方式都可以实现细胞和角质酶的高产。综合比较，恒速流加对于B.subtilisWSH06—07发酵培养来说，无论是细胞得率还是角质酶的高产量、高得率和高生产强度都是较理想的选择。经过31h的恒速流加培养，DCW达到52.76g/L，酶活最大达545.87U/mL。

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文摘

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第一章绪 论

1.1角质及角质酶

1.1.1角质

1.1.2角质酶

1.2角质酶的来源

1.3角质酶的结构

1.4角质酶的分泌途径

1.5角质酶的应用

1.6国内外研究动态

1.7角质酶研究目的和意义

1.8本论文研究的主要内容

第二章摇瓶水平上重组B.subtilis生产角质酶发酵条件的优化

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1菌种

2.2.2试剂

2.2.3主要仪器

2.2.4培养基

2.2.5培养方法

2.2.6分析方法

2.3结果与讨论

2.3.1种子生长曲线的确定

2.3.2种龄对产酶的影响

2.3.3质粒稳定性和包涵体对发酵的影响

2.3.4单因素方法考察了碳源对菌体生长和产酶的影响

2.3.5 Plackett-Burman实验设计筛选发酵过程中影响角质酶生产的主要参数

2.3.6 Box-Behnken实验设计进一步优化角质酶发酵条件

2.3.7摇瓶水平优化环境条件对角质酶发酵的影响

2.4本章小结

第三章3L发酵罐上重组B.subtilis生产角质酶发酵条件优化

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1菌种

3.2.2培养基

3.2.3培养方法

3.2.4分析方法

3.3结果与讨论

3.3.1溶氧对重组B.subtilis发酵过程的影响

3.3.2pH对角质酶发酵的影响

3.3.3温度对角质酶分批发酵的影响

3.4本章小结

第四章补料发酵法生产角质酶

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1菌种

4.2.2培养基

4.2.3培养方法

4.2.4控制策略

4.2.5分析方法

4.3结果与讨论

4.3.1提高初糖浓度对角质酶的分批发酵的影响

4.3.2分批补加蔗糖对角质酶发酵的影响

4.3.3恒速流加对角质酶发酵的影响

4.3.4不同培养方式下角质酶生产情况比较

4.4本章小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文