一种重组角质酶的发酵生产工艺

摘要

本发明公开了一种重组角质酶的发酵生产工艺，属于发酵工程技术领域。本发明采用重组大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)作为生产菌种，通过在发酵4-5个小时后连续补加甘油控制一定的残余甘油浓度，发酵6-7个小时一次性添加甘氨酸，发酵8-9个小时候连续补加乳糖控制一定残余乳糖浓度，发酵培养28-32小时后，角质酶的酶活达到500U/mL。本发明采用工业上常用的甘油、蛋白胨、酵母粉等原料进行生产，适于大规模生产，通过补料和诱导发酵调控，发酵周期比摇瓶发酵缩短一半，最高酶活比摇瓶发酵提高了5倍，为基因工程菌的扩大生产奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于酶发酵工程技术领域，特别涉及了一种重组角质酶的发酵生产工艺。

背景技术

角质酶是一种多功能酶，属于丝氨酸酯酶的一种，相对分子量约为22-30kDa，是一种具有称作α/β水解酶折叠的共同结构框架的蛋白质，既可水解不溶性多聚体角质，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯等。除了水解反应外，角质酶还能参与酯化、转酯化等反应。因此其在纺织工业、食品工业以及生物催化、化工工业等诸多领域有着广泛的应用前景。

角质酶的研究历史较短，目前仍没有工业化生产角质酶的成功实例。国内关于角质酶的研究较少，江南大学毕凤珍等(Thermobifida fusca产角质酶摇瓶发酵条件研究，应用与环境生物学报，2005，11(5)：608-610)、张守亮等(角质酶产生菌Thermobifida fusca WSH03-11诱变及高产突变株发酵条件优化，化工进展，2006年第25卷第5期)以Thermobifida fuscaWSH03-11为研究对象，考察了营养和环境条件对该菌发酵条件的影响，但酶活较低，难以实现工业化。张芙华等(pH两阶段控制策略发酵生产重组角质酶，中国生物工程杂志，2008，28(5)：59-64)以角质酶基因工程菌BaciLLus subtiLis WSHB06-07为研究对象，采用不同pH控制策略，角质酶酶活有了较大的提高，达170U/mL。国外在角质酶发酵条件优化方面开展的工作较少。例如：2002年，CaLado等(DeveLopment of a fed-batch cuLtivation strategy forthe enhanced production and secretion of cutinase by a recombinant Saccharomyce scerevisiaeSU50 Strain，Biosci Bioeng，2003，96：141～148)以Saccharomyces cerevisiae为宿主构建了角质酶基因工程菌，并在发酵罐上进行了发酵条件优化，酶活最高可达120U/mL。2007年Piod等(Optimizing the production of cutinase by Fusarium oxysporumusing response surfacemethodoLogy，Enzyme Microb TechnoL，2007，43：613～619)从植物病原菌中筛选得到非致病镰刀菌，摇瓶水平上酶活仅有22.7U/mL。同年Macedo等(Production of cutinase by Fusariumoxysporum in soLid-state fermentation using agro-industriaL residues，BiotechnoL，2007，131：211～241)采用固体发酵方法生产角质酶，但酶活仅有17.7U/mL。

综上所述，国内外关于角质酶的发酵生产存在以下问题，一是野生菌产酶量低，基因工程菌表达量不高；二是重组大肠杆菌产细菌角质酶周期较长，生产强度低。上述问题已经成为角质酶实现工业化生产和应用推广的技术瓶颈。鉴于角质酶巨大的应用市场潜力，对角质酶高产菌采取有效的发酵优化策略，成为加速其产业化的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组角质酶的发酵生产工艺，解决现有发酵工艺中角质酶酶活不高，难以实现工业化应用的问题。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种补料生产角质酶的方法，以重组大肠杆菌是Tfu_0883/pET20b(+)/E.coLi BL21(DE3)为生产菌种(Identification and characterization of bacterial cutinase，J Biol Chem，283，25854-62)，具体过程如下：

(1)种子培养：将-80℃甘油管保存的菌种接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速200rpm/min，培养温度37℃，初始pH值7.10，培养时间8小时；

(2)发酵培养：将培养好的种子液按接种量5％接入3L发酵罐进行发酵培养(装液量1L)发酵培养28-32小时；在发酵培养中，向发酵罐中通入无菌空气，通气量1.5L/min，设定培养温度35℃、搅拌转速为500rpm/min；流加30％的氨水控制发酵培养pH在7.0-7.1；发酵培养28-32小时；

(3)甘油补料：发酵培养进行到4-5小后，补加500g/L的甘油补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L；

(4)乳糖诱导：发酵培养8-9小时(OD₆₀₀为30)后，通过补加浓度为200g/L乳糖补料液，使发酵液乳糖浓度控制在4-6g/L；

(5)甘氨酸补料：发酵培养6-7小时(OD₆₀₀为15)后，一次性添加甘氨酸至终浓度为0.5％(质量分数)。

所述种子培养基中氨苄青霉素浓度为100mg/L。

所述发酵培养基中氨苄青霉素浓度为100mg/L。

所述种子培养基的组成为：工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH7.10。

所述发酵培养基的组成为：甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L，KH₂PO₄2.31g/L，K₂HPO₄.3H₂O 16.43g/L。

甘油含量的测定方法采用HPLC：Zorbax Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，进样量：10μL，差示折光检测器温度：35℃，流速：1.0mL/min，流动相：纯水；发酵培养4小时后，每隔一小时，对发酵液中甘油浓度进行一次测定，根据测定结果加入补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L。

乳糖浓度的测定方法参见GB/T 5413.5-1997；每隔一小时，对发酵液中乳糖浓度进行一次测定，根据结果加入乳糖诱导液，使发酵液中乳糖浓度维持在4-6g/L。

角质酶活性测定：

以对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物，采用分光光度法在20℃下测定。反应体系为1ml，包括960μl缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM NaCl，pH 8.0)，20μl酶液，20μlpNPB(1mM，乙腈中保存)，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活定义：每分钟催化pNPB水解生成1μmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

本发明的有益效果：

(1)本发明解决了现有发酵工艺中角质酶酶活不高，难以实现工业化应用的问题，使用所述工艺可大大提高角质酶的产量，实现工业化生产。

(2)本发明采用工业上常用的蛋白胨、酵母粉等原料进行生产，成本低适于大规模生产。

(3)通过补料和诱导发酵调控，发酵周期比摇瓶发酵(80小时)缩短一半，酶活提高了5倍，取得了预料不到的效果，为基因工程菌的扩大生产奠定了基础。

具体实施方式

对比例：

菌种的准备：

本实验室自行构建菌株Tfu_0883/pET20b(+)/E.coLi BL21(DE3)(Chen S，Tong X，Woodard RW，Du GC，Wu J，Chen J，Identification and Characterization ofBacterial Cutinase，The Journal of Biological Chemistry，2008，283(28)25854-25862)。

发酵培养：

TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养至OD达1.0后用终浓度0.4mMIPTG诱导，降温至24℃培养，80h时产酶达90U/mL，此时菌体开始衰亡。

实施例

菌种的准备：

本实验室自行构建菌株Tfu_0883/pET20b(+)/E.coLi BL21(DE3)(Chen S，Tong X，Woodard RW，Du GC，Wu J，Chen J，Identification and Characterization ofBacterial Cutinase，The Journal of Biological Chemistry，2008，283(28)25854-25862)。

种子液培养：

将-80℃甘油管保存的菌种接入种子培养基中，种子培养基配方为：工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，氨苄青霉素100mg/L。使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度37℃，初始pH值7.10，培养时间8小时。

发酵培养：

将培养好的种子液按接种量5％接入3L发酵罐进行发酵培养(装液量1L)；发酵培养基配方为：甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L，KH₂PO₄2.31g/L，K₂HPO₄·3H₂O16.43g/L；氨苄青霉素100mg/L；在发酵培养中，向发酵罐中通入无菌空气，通气量1.5L/min，培养温度35℃，搅拌转速为500rpm/min，流加氨水控制pH值为7.0-7.1。

甘油补料：

发酵培养进行到4-5小后，通过补加500g/L的甘油补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L。

甘油含量的测定方法采用HPLC：Zorbax Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，进样量：10μL，差示折光检测器温度：35℃，流速：1.0mL/min，流动相：纯水；发酵培养4小时后，每隔一小时，对发酵液中甘油浓度进行一次测定，根据测定结果加入一定体积的补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L。

乳糖诱导：

发酵培养8-9小时(OD₆₀₀为30)后，连续流加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液乳糖浓度控制在4-6g/L。

发酵液中乳糖浓度的测定方法参见GB/T 5413.5-1997；每隔一小时，对发酵液中乳糖浓度进行一次测定，根据结果加入一定体积的乳糖诱导液，使发酵液中乳糖浓度维持在4-6g/L。

甘氨酸补料：

发酵培养6-7小时(OD₆₀₀为15)后，一次性添加甘氨酸至终浓度为0.5％(质量分数)。

发酵培养时间30小时后，最终角质酶的酶活为500U/mL。