乳酸菌Lactococcus lactis SYFS1.009生物法制备γ-氨基丁酸的研究

摘要

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，在哺乳动物体内GABA是一种抑制性神经递质，介导40％以上的抑制性神经信号。GABA具有提高脑活力、营养神经、降低血压，安定精神、改善肝肾机能等功能，因而它在功能食品中具有广泛的应用前景。 本论文首先进行了乳酸菌Lactococcuslactissubsp.lactisSYFS1.009补料分批发酵制备GABA的研究，并在此基础上进行了200L扩大化实验。随后研究了乳酸菌细胞转化法制备GABA的工艺，同时探讨了外源辅酶及缓冲盐对细胞转化的影响，建立起产物生成动力学模型用于预测和指导实际生产。 底物分批添加是指在反应过程中间歇地添加底物，使目标产物GABA在发酵液中得到不断积累，从而提高底物的利用率，解决了发酵液中L-谷氨酸与GABA分离困难的问题。实验通过流加6mol/L的NaOH控制发酵pH在5.0，同时间歇补加葡萄糖和L-MSG，谷氨酸钠补加3次后发酵110h，发酵液中GABA的含量达5.41g/L，L-谷氨酸剩余0.68g/L，利用率达94.5％，GABA得率为29.6％。200L扩大化实验的结果表明，补料分批发酵在小试的基础上是可以放大运用的。GABA产品纯度为53％，水分8.6％，灰份1.8％。经过多次重复实验GABA产量稳定，为工业化大规模生产奠定了较好的基础。 研究了乳酸菌细胞转化法制备GABA的工艺，分别讨论了菌体浓度、底物浓度、菌龄、缓冲液种类、温度、pH等因素对产量的影响。在单因素的基础上，采用正交设计进行优化，综合实际生产得到的最优条件为：菌龄12h，菌体浓度10g/L，L-MSG浓度10g/L，酶转化在45℃，0.2mol/L、pH4.2的醋酸缓冲液(内含O.1mmol/LPLP)中进行，15h反应。在此条件下菌体可重复利用四次。 探讨了辅酶在细胞转化过程中的影响。通过测定酶反应动力学常数的变化，发现外源辅酶主要改变了表观米氏常数，Km值从22.95mmol/L减小到4.65mmol/L，但对最大反应速率的影响不大。所使用的缓冲液除维持体系pH值外，对稳定酶蛋白结构防止辅酶脱落可能也起到一定的作用。在大量实验基础上通过计算机拟和出产物生成动力学模型为：P=[6×10-4(E02S0)+2.204][1-exp(-0.282t)]，该模型在一定程度上可用于指导和预测实际生产。

目录

文摘

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声明

第一章绪论

1.1非蛋白氨基酸

1.2 γ-氨基丁酸的理化性质及结构

1.3γ-氨基丁酸的生理功能

1.3.1在植物中的功能

1.3.2在动物中的功能

1.4谷氨酸脱羧酶概述

1.5 GABA的天然存在和制备

1.5.1 GABA的天然分布和积累

1.5.2 GABA的制备方法

1.6立题背景

1.7本课题研究内容

第二章控制pH补料分批发酵的研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1主要试剂

2.2.2主要仪器

2.2.3菌种及保藏方法

2.2.4培养基

2.2.5主要实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1Lc.lactis SYFS1.009生物合成GABA的过程

2.3.2控制pH补加葡萄糖发酵的研究

2.3.3 L-谷氨酸钠间歇分批添加的研究

2.3.4谷氨酸钠间歇分批添加底物利用率及GABA得率计算

2.3.5 200L扩大化发酵实验

2.3.6产品成分分析

2.4本章小节

第三章乳酸菌细胞转化法制备GABA的工艺研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1菌体浓度对GABA产量的影响

3.3.2底物浓度对GABA产量影响

3.3.3不同缓冲体系对GABA产量的影响

3.3.4 pH对GABA产量的影响

3.3.5转化时间的影响

3.3.6体系温度对产量的影响

3.3.7菌龄对GABA产量的影响

3.3.8 PLP的添加量对产量的影响

3.4 正交实验确定最佳酶反应条件

3.5菌体生产能力指标

3.6本章小节

第四章外源辅酶及缓冲盐对细胞转化的影响及产物生成动力学模型研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1主要试剂

4.2.2主要仪器

4.2.3菌种

4.2.4培养基

4.2.5实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1辅酶在反应过程中的稳定性

4.3.2外源辅酶对反应动力学常数的影响

4.3.2体系里的缓冲盐对反应的影响

4.3.3细胞转化过程中GABA变化

4.3.4细胞转化生成GABA动力学模型探讨

4.3.5动力学模型验证

4.4本章小节

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文