大米多肽的分离纯化及其抗氧化活性的研究

摘要

酶法分离提取大米多肽和淀粉的反应条件温和，工艺简单，提取所得大米淀粉的品质高于碱法提取所得淀粉的品质。作为大米淀粉的副产物，大米多肽具有一些生理活性，如降胆固醇及抗氧化活性等。但在大米蛋白水解液中，因可溶性糖的溶出，影响了大米多肽的品质及生产工艺。本文以大米为对象，采用酶法同时分离大米蛋白和淀粉，在获得高品质淀粉的同时得到具有生物活性的大米多肽，重点对大米多肽进行了除糖、降胆固醇活性和抗氧化活性的研究，并最终对分离得到的单一具有高活性的肽的氨基酸序列进行了鉴定。 首先在确定大米蛋白水解液中存在的糖主要来源于水解进程的基础上，以ProteaseN水解大米所得水解液作为研究对象，通过分析水解液中多肽与糖的相对分子量分布及组成，确定利用以D201强阴离子交换树脂为载体进行大米多肽与糖的分离。考察了离子交换工艺参数对大米蛋白回收率和脱糖率的影响，得到最佳的离子交换条件为：使用磷酸盐缓冲液(pH7.0，离子强度为0.01mol/L)作为起始缓冲液平衡树脂。平衡后，将硼砂与糖按1:8的摩尔比混合均匀后上样，上样体积与树脂的体积比为1:1。对吸附在树脂上的大米多肽进行洗脱，洗脱时采用二次洗脱，先用水洗脱(1倍体积)，后用0.1mol/LHC1洗脱(2倍体积)。收集未吸附液及洗脱液，旋转蒸发后冷冻干燥。最终蛋白回收率为98.2％，脱糖率为84.3％。冷冻干燥后样品的干基蛋白含量为80.0％，干基糖含量为9.0％。 比较了ProteaseN和Alcalase水解所得粳米肽和糯米肽的降胆固醇活性及抗氧化活性。结果表明，ProteaseN水解所得粳米肽和Alcalase水解所得粳米肽的降胆固醇活性较高，两者的活性接近，浓度为7.5mg/mL时其降胆固醇活性为38％左右，但均低于大豆肽的降胆固醇活性(44.60％)；抗氧化活性主要研究了.DPPH、和O2这三种自由基的清除率。结果表明，ProteaseN水解所得粳米肽的抗氧化活性最好，清除DPPH的IC50值为7.5mg/mL，清除OH的IC50为12.6mg/mL，清除O-2的IC50为24.7mg/mL。 利用RP-HPLC分离纯化了ProteaseN水解所得粳米肽，经过制备型RP-HPLC分离后主要得到14个峰，组分6具有最高的DPPH清除率(IC50为32.6ug/mL)，组分2具有最高的OH清除率(蛋白浓度为35ug/mL时清除率为66.2％)，组分4具有最高的O2清除率(蛋白浓度为35ug/mL时清除率为39.5％)。通过LC-MS对这三个组分进行结构鉴定，组分2的肽序列可能为VAK/AKV、AAAA、VN/VGG、VDM/VFV，组分4的肽序列可能为CCIIK/CCLIK/CCIIQ/CCLIQ、MFM和WDP/WLV/WIV，组分6的肽序列可能为EYDP/EYLN/EYIV、PGHV/GHVP和IPV/PVI。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1大米蛋白的酶法改性

1.2大米蛋白与淀粉的酶法分离

1.3小分子肽和小分子糖的分离

1.4大米多肽的功能特性的研究

1.4.1降胆固醇肽的活性研究

1.4.2抗氧化肽的活性研究

1.5多肽的分离纯化、结构鉴定的研究现状

1.6立题背景和意义

1.7论文主要内容

第二章大米多肽的脱糖工艺的研究

2.1前言

2.2材料与仪器

2.2.1材料

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1常规成分分析

2.3.2蛋白酶酶活的测定

2.3.3相同酶活力条件下，大米淀粉和蛋白质的酶法分离

2.3.4气相色谱法测定单糖组分

2.3.5相对分子量分布的测定

2.3.6大米蛋白水解液的制备

2.3.7大米酶水解过程中糖产生阶段的确定

2.3.8硼酸络合法分离大米多肽和可溶性糖工艺参数的优化

2.3.9树脂洗脱工艺的选择

2.4结果与讨论

2.4.1相同酶活下，不同蛋白酶分离大米淀粉和蛋白质效果比较

2.4.2大米在水解的三个阶段中糖和蛋白质的含量

2.4.3大米水解液中糖与蛋白质(肽)分离工艺的确定及优化

2.4.4树脂洗脱工艺的优化

2.5本章小结

第三章大米多肽的降胆固醇及抗氧化活性的研究

3.1前言

3.2材料与仪器

3.2.1材料

3.2.2主要仪器

3.3实验方法

3.3.1模拟胆汁胶束的制备方法

3.3.2胆固醇含量的测定方法

3.3.3胆固醇抑制率计算方法的确定

3.3.4清除DPPH·活性的测定

3.3.5清除超氧阴离子(O2-)活性的测定

3.3.6清除羟基自由基(OH·)活性的测定

3.4结果与讨论

3.4.1大米多肽体外降胆固醇活性的研究

3.4.2大米多肽抗氧化活性的研究

3.5本章小结

第四章抗氧化粳米肽的分离纯化及鉴定

4.1前言

4.2材料与仪器

4.2.1材料

4.2.2主要仪器

4.3实验方法

4.3.1样品制备

4.3.2肽的相对分子量分布的测定

4.3.3半制备RP-HPLC分离抗氧化肽

4.3.4 RP-HPLC分析抗氧化肽

4.3.5蛋白含量的测定

4.3.6清除DPPH·活性的测定

4.3.7清除超氧阴离子活性的测定

4.3.8清除OH·活性的测定

4.3.9 LC-MS测定肽的结构

4.4结果与讨论

4.4.1脱糖后粳米肽及其超滤后的相对分子量分布

4.4.2半制备RP-HPLC分离Protease N水解所得粳米肽

4.4.3 LC-MS分析组分结构

4.5本章小结

主要结论

问题与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文