一种纤溶酶SPFE-Ⅲ的生物制备、分离纯化及酶学性质研究

摘要

血栓栓塞性疾病主要包括脑血栓、心肌梗死、静脉血栓等，是目前临床上死亡率最高的疾病之一，并且在世界范围内的发病率正逐年上升，因此人们一直都在研制开发新型的溶血栓药物。本文从亚洲传统发酵食品--是酱中筛选到一株产纤溶酶能力较强的菌株，由中国典型培养物保藏中心定名为Bacillus sp.nov.SK006(CCTCC NO.:M205071)，已经证明该菌株能产生四种不同的纤溶酶，本文在优化该菌产酶条件的基础上，主要对芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006产生的其中一种纤溶酶(SPFE-Ⅲ)作了深入的研究。
　　 首先在摇瓶水平上考察了培养基组成及培养条件对Bacillus sp.nov.SK006发酵产纤溶酶能力的影响，结果表明该菌株产酶最佳的培养基组分为:葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨30 g/L，Na2HPO4·12H2O15 g/L，NaH2PO4·2H2O1.3 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，CaCl20.1 g/L；最佳培养条件:种龄18 h，接种量3%，发酵周期24 h，初始pH为7.0，摇床转速180 r/min，发酵温度37℃，在此条件下发酵液纤溶活性(以plasmin为标准)高达2.63 U/mL，是优化前0.70 U/mL的3.76倍。
　　 芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006的发酵液经乙醇沉淀、离子交换层析(DEAE-Sepharose CL-6B)、凝胶过滤层析(Superdex75)后分离纯化出一种电泳纯的纤溶酶SPFE-Ⅲ，分子量约为42.8 kDa，酶活为7.1 U/mg(以plasmin为标准)。SPFE-Ⅲ对纤维蛋白原的降解过程为最先降解Q链，其次是γ链，而对β链的降解最缓慢；利用加热纤维蛋白平板法研究纤溶酶SPFE-Ⅲ对纤维蛋白的作用方式，结果发现该酶对纤维蛋白有直接降解作用，而对纤溶酶原的敏感性较低。
　　 其次研究了纯化后纤溶酶SPFE-Ⅲ的酶学性质:最适反应温度为30-40℃，最适反应pH范围为7.0-8.0，在40℃下保温1 h剩余酶活力约为60%，而在50℃保温1 h剩余酶活力只有30%左右，纤溶酶SPFE-Ⅲ对高温较为敏感。金属离子实验表明:在实验选择的范围内，除Ba2+外其它金属离子对纤溶酶SPFE-Ⅲ纤溶活性均有一定程度的抑制作用，其中Cu2+、Mn2+、Fe3+和Zn2+的抑制作用较强，抑制率为50%左右。抑制剂实验表明:蛋白酶抑制剂对纤溶酶SPFE-Ⅲ有不同程度的抑制作用，EDTA和β-毓基乙醇对纤溶酶SPFE-Ⅲ都有较强的抑制作用。
　　 最后分别选择了三种人工合成的发光底物D-Val-Leu-Arg-pNA、D-Val-Leu-Lys-pNA和N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA与纤溶酶SPFE-Ⅲ反应。SPFE-Ⅲ对底物N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有最强的专一性，其酰胺水解活性是75.77 AU，该底物是胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的最适底物。对N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的米氏常数Km为0.239 mmol/L，酶反应转换数kcat为475.5 s-1，表明纤溶酶SPFE-Ⅲ对该底物的亲和性较好，反应速度较高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 血栓、血栓栓塞性疾病

1.2 凝血途径、血栓形成机理

1.3 纤溶系统

1.3.1 纤溶酶原(plasminogen，plg)

1.3.2 纤溶酶(plasmin)

1.3.3 纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,PA)

1.3.4 纤溶酶原激活剂抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI)

1.4 血栓栓塞性疾病的治疗

1.5 纤溶酶类溶栓剂的应用

1.5.1 链激酶(streptokinase，SK)

1.5.2 尿激酶(urokinase，UK，u-PA)

1.6 纤溶酶类溶栓剂的研究与开发

1.6.1 溶栓剂的主要来源

1.6.2 微生物发酵法产纤溶酶的研究进展

1.6.3 纤溶酶活性检测方法的研究状况

1.7 本课题立题背景及主要研究内容

第二章 芽孢杆菌SK006产纤溶酶摇瓶发酵条件研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006的生长曲线

2.3.2 芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006的初步发酵实验

2.3.3 发酵培养基优化

2.3.4 发酵条件的优化

2.4 优化后芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006的发酵过程曲线

2.5 本章小结

第三章 纤溶酶SPFE-Ⅲ的分离纯化和纤溶机理研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 主要实验材料

3.2.3 主要实验仪器

3.2.4 主要实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 乙醇分级沉淀

3.3.2 Superdex 75(10/300 GL)凝胶色谱

3.3.3 SDS-PAGE电泳鉴定及纯化结果

3.3.4 纤溶酶SPFE-Ⅲ纤溶机理

3.4 本章小结

第四章 纤溶酶SPFE-Ⅲ酶学性质的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 主要实验试剂

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 主要实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 温度对纤溶酶SPFE-Ⅲ酶活的影响

4.3.2 pH值对纤溶酶SPFE-Ⅲ纤溶活性的影响

4.3.3 金属离子对纤溶酶SPFE-Ⅲ活性的影响

4.3.4 蛋白酶抑制剂对纤溶酶SPFE-Ⅲ活性的影响

4.3.5 纤溶酶SPFE-Ⅲ的酰胺水解活性的研究

4.3.6 SPFE-Ⅲ对生色底物N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA作用动力学

4.4 本章小结

主要结论

致 谢

参考文献

附录：在攻读硕士学位期间发表的论文